基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的雙黃連抗炎作用機(jī)制分析

炎癥反應(yīng)與機(jī)體息息相關(guān)，既是人體重要的自我防御機(jī)制，也是大多數(shù)急慢性疾病的來(lái)源。研究表明，炎癥參與了臨床大多數(shù)疾病的發(fā)展變化，包括肺炎、膿毒血癥、酒精性肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和腫瘤等。雙黃連由金銀花、黃芩、連翹三味藥材組成，廣泛應(yīng)用于臨床。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三味藥材都具有抗菌抗病毒，解熱抗炎，保肝抗氧化，免疫調(diào)節(jié)等作用；其中，據(jù)報(bào)道黃芩和連翹還具有抗腫瘤作用；黃芩具有抗缺血再灌注損傷的作用。盡管目前對(duì)于雙黃連制劑抗炎作用機(jī)制的研究已有大量報(bào)道，但在有效成分、靶點(diǎn)以及通路上對(duì)其整體的藥理作用機(jī)制尚未完全闡明。

中藥所含成分復(fù)雜，多個(gè)靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用，在治療很多疾病方面有不可取代的作用。正因?yàn)槎嘟M分協(xié)同作用的特點(diǎn)，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制更為復(fù)雜，如何科學(xué)系統(tǒng)地研究其藥理作用機(jī)制是中藥現(xiàn)代化的難點(diǎn)之一。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于多向藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)，利用網(wǎng)絡(luò)建模的方法，從系統(tǒng)的角度出發(fā)，綜合分析主要藥效成分、潛在作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制之間的相互聯(lián)系，與中醫(yī)整體觀念相呼應(yīng)。本研究于2018年8月至2019年11月根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路綜合分析雙黃連口服制劑的主要藥效成分和可能的分子機(jī)制，以期為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建雙黃連口服制劑的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)

根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine system pharmacology platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“金銀花”“黃芩”“連翹”為關(guān)鍵詞檢索這三味藥材的全部化學(xué)成分，其中金銀花含有236個(gè)，黃芩含有143個(gè)，連翹含有150個(gè)，金銀花和黃芩含有的相同成分18個(gè)，金銀花和連翹含有的相同成分21個(gè)，黃芩和連翹含有的相同成分11個(gè)，三味藥材共有的化學(xué)成分有4個(gè)，故而“金銀花-黃芩-連翹”中含有的所有相關(guān)化學(xué)成分共482個(gè)。

1.2 活性化合物的篩選

藥物在體內(nèi)需經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝、排泄的過(guò)程，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是指藥物口服后到達(dá)體循環(huán)的相對(duì)量，高口服生物利用度是藥物是否具有生物活性的一個(gè)重要指標(biāo)；類藥性代表化合物與已知藥物的相似性，類藥性≥0.18表示該成分與Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)里藥物具有一定的相似性；Caco-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，Caco-2細(xì)胞滲透率決定人體吸收藥物的生物利用度。本研究以口服生物利用度閾值OB≥30%，類藥性≥0.18，Caco-2細(xì)胞滲透率≥0.4作為篩選條件，通過(guò)評(píng)價(jià)化合物的體內(nèi)過(guò)程選擇生物活性較高的化合物。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)尋找42個(gè)活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），選擇物種為人，進(jìn)行歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化命名，最終得到三味藥材活性成分的潛在靶點(diǎn)為141個(gè)。利用Cytoscape3.6.1軟件將活性化合物與其潛在靶點(diǎn)蛋白生成（Compound-target，C-T）網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，探究三味藥材的藥理作用機(jī)制及機(jī)理。

1.4 炎性疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)比較基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https：//ctdbase.org/），以“inflammation”為關(guān)鍵詞檢索與炎癥相關(guān)的基因。

1.5 蛋白互作（protein

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protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在生化過(guò)程中，蛋白往往通過(guò)相互作用形成大分子復(fù)合物來(lái)完成其生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），獲取上述雙黃連和炎癥相關(guān)的交集靶蛋白在系統(tǒng)水平的相互作用信息。將可信度設(shè)為≥0.7，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，用FDR錯(cuò)誤控制法（FDR＜0.05）對(duì)P值做檢驗(yàn)校正，設(shè)定閾值P＜0.05，得到潛在靶點(diǎn)參與表達(dá)的生物學(xué)通路，探究雙黃連的藥理作用機(jī)制。

1.7 成分

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靶點(diǎn)

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信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集蛋白與其相關(guān)聯(lián)的藥對(duì)中成分，構(gòu)建成與炎癥相關(guān)的雙黃連化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。交集蛋白與KEGG富集出的生物通路構(gòu)建出炎癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.6.1軟件中的合并功能將以上兩種網(wǎng)絡(luò)合并，從而得出成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 化合物的篩選

符合篩選條件的化合物共有55個(gè)。其中，JYH7（豆甾醇，Stigmasterol）是金銀花和黃芩共有成分，HQ2（漢黃芩素，wogonin）是黃芩和連翹共有成分，三者都含有JYH6（β-谷甾醇，betasitosterol）。有9個(gè)化學(xué)成分沒(méi)有相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，所以共有42個(gè)化學(xué)成分符合篩選條件，其中金銀花7個(gè)，黃芩24個(gè)，連翹11個(gè)，見(jiàn)表1。

2.2 化合物靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP平臺(tái)檢索這42個(gè)活性化合物的潛在作用靶點(diǎn)，共得到141個(gè)靶點(diǎn)。將這些成分與靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，得到的網(wǎng)絡(luò)圖包括163個(gè)節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的度（degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)，度值越大表明節(jié)點(diǎn)越重要。從表2中可以看出，度值較大（度值≥25）的化合物為HQ2，HQ4（黃芩素，baicalein），JYH6，JYH7；度值較大的邊（度值≥25）前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2），前列腺素G/H合成酶1（Prostaglandin G/Hsynthase 1，PTGS1）等。

表1 雙黃連中含有的42個(gè)與炎癥相關(guān)的化合物信息

2.3 雙黃連與炎癥交集靶點(diǎn)

分別利用TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)查詢出雙黃連候選化合物141個(gè)靶點(diǎn)，炎癥417個(gè)相關(guān)基因。其中雙黃連與炎癥的共有基因53個(gè)，即雙黃連候選化合物作用靶點(diǎn)與炎癥共有53個(gè)交集蛋白。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)相關(guān)設(shè)置，得到53個(gè)交集蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。圖中共有53個(gè)節(jié)點(diǎn)，397條邊，平均度值為15。其中節(jié)點(diǎn)代表交集蛋白，邊則表示蛋白間的關(guān)聯(lián)作用，線條的粗細(xì)表示關(guān)聯(lián)度的大小。

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中得到53個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，共得到519條GO條目。在這些生物過(guò)程里，根據(jù)FDR錯(cuò)誤控制法（FDR≤0.05）確定了77個(gè)GO條目。其中，這些條目中包含58個(gè)生物過(guò)程的條目，11個(gè)分子功能的條目，8個(gè)細(xì)胞組成的條目，主要參與酶結(jié)合，血管生成，激素調(diào)節(jié)，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，缺氧，衰老等。見(jiàn)圖2。

2.6 KEGG通路富集分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中53個(gè)靶蛋白基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，共有90條生物通路，其中錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05的有46條。其中包括Pathways in cancer，Hepatitis B，Colorectal cancer，Proteoglycans in cancer，TNF signaling pathway，Apoptosis，Small cell lung cancer，p53 signaling pathway等。根據(jù)P值排序，前30個(gè)生物通路見(jiàn)圖3。

2.7 成分

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靶點(diǎn)

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信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

整理炎癥相關(guān)的成分靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息及相關(guān)靶點(diǎn)通路關(guān)聯(lián)信息，并將關(guān)聯(lián)信息上傳至Cytoscape 3.6.1軟件中，并利用該軟件的合并功能構(gòu)建雙黃連活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。圖中包括成分36種，用三角形表示；炎癥相關(guān)靶點(diǎn)53個(gè)，用橢圓形表示；信號(hào)通路30條，用長(zhǎng)方形表示。篩選出的雙黃連候選活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號(hào)通路，相互協(xié)調(diào)，通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

其中，根據(jù)度值前五位的化合物為HQ2，HQ4，JYH3（β-胡蘿卜素，beta-carotene），HQ1（金合歡素，acacetin），HQ9（千層紙素A，oroxylin A），見(jiàn)表3；度值前五位的靶點(diǎn)為PTGS2，PTGS1，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible，NOS2），轉(zhuǎn)錄因子p65（Transcription factor p65，RELA），外消旋-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1），見(jiàn)表4。

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選出雙黃連抗炎的36個(gè)活性成分、53個(gè)交集靶點(diǎn)和30條信號(hào)通路。通過(guò)分析成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)度值前五位的化學(xué)成分為黃芩素、漢黃芩素，β-胡蘿卜素，金合歡素，千層紙素A，可能是雙黃連抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃芩素快速抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）的釋放，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-6（IL-6）和一氧化氮的減少發(fā)揮抗炎作用。黃芩素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路，保護(hù)糖尿病心肌病大鼠免受氧化應(yīng)激和心肌組織炎癥的損害。漢黃芩素通過(guò)抑制一氧化氮，細(xì)胞因子，趨化因子和生長(zhǎng)因子在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。漢黃芩素通過(guò)抑制Akt磷酸化，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，黏附分子表達(dá)來(lái)治療急性肺損傷。β-胡蘿卜素能夠抑制活性氧（ROS）介導(dǎo)的炎癥信號(hào)，并減少炎癥介質(zhì)在感染組織中的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-8（IL-8），NOS2和環(huán)氧化酶-2（COX-2）。金合歡素通過(guò)干擾PI3K/Akt/IKK和MAPK的活化，從而下調(diào)巨噬細(xì)胞中炎性NOS2和COX-2基因的表達(dá)來(lái)預(yù)防炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)生。金合歡素通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子Toll樣受體4（TLR4），IL-6和TNF-α的釋放，從而減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明其可作為治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的新藥。千層紙素A通過(guò)抑制COX-2蛋白的表達(dá)，一氧化氮、前列腺素E2的產(chǎn)生來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。以上報(bào)道證實(shí)了雙黃連中黃芩素、漢黃芩素，β-胡蘿卜素，金合歡素，千層紙素A五種成分的抗炎活性，我們的研究結(jié)果與其一致。度值前五位的靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA、AKT1。PTGS前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶，分為結(jié)構(gòu)型PTGS1和誘導(dǎo)型PTGS2，PTGS1參與機(jī)體正常的生理功能；PTGS2作為炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶，在多種體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下生成的主要產(chǎn)物前列腺素，是重要的炎癥介質(zhì)，參與炎癥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。NOS2在細(xì)胞受到細(xì)胞因子或免疫微生物刺激時(shí)，催化產(chǎn)生大量一氧化氮，過(guò)多的一氧化氮通常會(huì)引起炎癥、疼痛、免疫紊亂等癥狀。RELA基因在調(diào)控炎癥的NF-κB信號(hào)通路中起著極其重要的作用，但尚未有研究報(bào)道雙黃連通過(guò)對(duì)RELA基因的調(diào)控來(lái)發(fā)揮藥理作用，因此此結(jié)果待進(jìn)一步確認(rèn)。AKT1基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程，AKT1的異常表達(dá)與癌癥有關(guān)。除RELA基因外，已有研究顯示其他幾個(gè)基因與雙黃連發(fā)揮抗炎作用息息相關(guān)。

表2 雙黃連化合物-炎癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

表3 雙黃連抗炎成分-靶點(diǎn)-信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中化學(xué)成分的節(jié)點(diǎn)及拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)（前12）

表4 雙黃連抗炎成分-靶點(diǎn)-信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)及拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)（前12）

通過(guò)對(duì)53個(gè)交集靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，GO功能富集主要表現(xiàn)在對(duì)酶和激素的調(diào)節(jié)、血管生成，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過(guò)程和分子功能上。KEGG通路富集分析中，很多基因富集到癌癥信號(hào)通路上如Pathways in cancer，Proteoglycans in cancer，Colorectal cancer，Small cell lung cancer。已有研究表明雙黃連中黃芩素通過(guò)降低基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)和上調(diào)P53途徑相關(guān)蛋白來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。漢黃芩素能夠上調(diào)凋亡蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/AKT和STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)自噬和凋亡細(xì)胞死亡抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。千層紙素A能使細(xì)胞周期停滯在G2/M期來(lái)抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。目前，未曾有雙黃連治療小細(xì)胞肺癌的報(bào)道，此結(jié)果有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。在Hepatitis B信號(hào)通路中，Guo等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連中黃芩素可顯著抑制乙型肝炎病毒DNA聚合酶，在體內(nèi)和體外均具有抗乙型肝炎病毒的活性。本研究可能為其治療乙型肝炎進(jìn)一步的分子機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。本研究顯示，還有一些基因富集到了Apoptosis信號(hào)通路，p53 signaling pathway，TNF signaling pathway中。李彥林等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連通過(guò)引起細(xì)胞凋亡的途徑來(lái)抑制大鼠白血病細(xì)胞增殖。雙黃連中漢黃芩素和黃芩素降低抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）的表達(dá)，通過(guò)p53依賴性方式通過(guò)人結(jié)腸癌細(xì)胞的Akt激活誘導(dǎo)凋亡。漢黃芩素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管生成的能力，其分子機(jī)制涉及活性氧，Ca，NF-κB，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體和腫瘤壞死因子。在激素相關(guān)的信號(hào)通路Thyroid hormone signaling pathway和Estrogen signaling pathway中，有結(jié)果表明雙黃連中黃芩素通過(guò)誘導(dǎo)凋亡和自噬來(lái)抑制未分化的甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但未見(jiàn)雙黃連通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素發(fā)揮作用的報(bào)道，因此此結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。雙黃連中漢黃芩素通過(guò)抑制雌激素受體和刺激內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮和NOS2的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。此項(xiàng)結(jié)果顯示雙黃連通過(guò)抑制雌激素受體來(lái)發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，由于中藥發(fā)揮藥效通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路，對(duì)雙黃連的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行分析。預(yù)測(cè)了雙黃連的主要藥效成分、潛在作用靶點(diǎn)和機(jī)制，對(duì)雙黃連進(jìn)一步的分子機(jī)制研究具有參考價(jià)值。然而，由于化合物篩選沒(méi)有考慮到量的影響和配伍變化，獲取信息的數(shù)據(jù)庫(kù)不全面性和滯后性，本研究存在一定的局限性。

圖1 雙黃連與炎癥的交集靶蛋白蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)

圖2 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)的基因本體（GO）富集條形圖

圖3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)靶點(diǎn)KEGG富集氣泡圖（前30）

圖4 雙黃連抗炎成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路