黏蛋白1基因小干擾RNA聯(lián)合丙泊酚抑制肺癌H460細(xì)胞生長的機(jī)制研究

肺癌占男性所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率的第一位，在女性中排名第二。肺癌的高發(fā)病率和死亡率與肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變密切相關(guān)。肺癌的基因療法，近年來發(fā)展迅速，其中一些已進(jìn)入臨床試驗。黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）是一種大的跨膜蛋白，具有N末端（MUC1-N）和C末端（MUC1-C）兩個亞基。以往研究顯示，MUC1在多種腫瘤中過表達(dá)，且參與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲等的調(diào)節(jié)。先前的研究表明MUC1可能是肺癌治療的新靶點，并且可能參與肺癌細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。然而，MUC1在肺癌進(jìn)展中的具體作用機(jī)制仍然知之甚少。丙泊酚是臨床上常用的一種麻醉誘導(dǎo)和維持的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗癌特性。研究顯示，丙泊酚能夠明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。然而敲低MUC1基因表達(dá)與丙泊酚聯(lián)合作用于肺癌是否具有協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞生長的作用目前尚不清楚。因此，本研究于2018年12月至2019年6月通過RNA干擾技術(shù)敲低MUC1的表達(dá)及丙泊酚單獨或聯(lián)合干預(yù)肺癌H460細(xì)胞，觀察對H460細(xì)胞生長的影響并探討其可能的機(jī)制，以期為肺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌H460細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；丙泊酚（英國AstraZeneca公司，批號GD187）；胎牛血清（美國HyClone公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol試劑（賽默飛世爾公司）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）試劑、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；特異性MUC1小干擾RNA（siRNA）和陰性對照siRNA Control（廣州銳博生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；SYBR Green PCR Master Mix實時熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；ECL發(fā)光試劑（上海愛必信生物科技有限公司）；MUC1抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體、p-Akt抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（美國Abcam公司）。

主要儀器：流式細(xì)胞儀（上海默瑞生物），型號Partec；多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器），型號spectra-MAXM5；高速離心機(jī)（日本日立公司），型號CR21GⅡ。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌H460細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置在5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，在倒置顯微鏡下觀察H460細(xì)胞生長狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)90%以上時使用胰蛋白酶傳代，實驗選擇對數(shù)增殖期的H460細(xì)胞。

1.3 特異性MUC1 siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞

對數(shù)生長期的H460細(xì)胞以胰酶消化后，收集細(xì)胞并種植到6孔板中，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)液更換成不含血清及雙抗的培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度為50%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將特異性MUC1 siRNA和陰性對照siRNA Control轉(zhuǎn)染至H460細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染MUC1 siRNA的H460細(xì)胞命名為si-MUC1組，轉(zhuǎn)染siRNA Control的H460細(xì)胞命名為si-NC組。

1.4 qPCR檢測H460細(xì)胞中MUC1 mRNA表達(dá)水平

分別收集轉(zhuǎn)染48 h后si-NC組和si-MUC1組H460細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加樣并合成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix qPCR檢測試劑盒進(jìn)行qPCR檢測。以相對定量2法分析各組H460細(xì)胞中MUC1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測H460細(xì)胞中MUC1蛋白表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染48 h后各組H460細(xì)胞，分別加入RIPA細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min提取細(xì)胞中總蛋白，BCA蛋白濃度檢測試劑測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，沸水中加熱使蛋白變性，取等量蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，封閉（5%脫脂奶粉）2 h，分別配置一抗，加入相應(yīng)一抗、二抗，室溫孵育2 h。加入ECL顯色試劑，成像，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，計算各組H460細(xì)胞中MUC1蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 丙泊酚對H460細(xì)胞活力的影響

對數(shù)生長期的H460細(xì)胞以5×10個/孔接種到96孔板中，待細(xì)胞長滿底部70%以上時，分別加入不同濃度（0、12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L）的丙泊酚干預(yù)H460細(xì)胞48 h，向每孔細(xì)胞中加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，采用全自動酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處吸光度值。計算細(xì)胞活力=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。根據(jù)細(xì)胞丙泊酚對H460細(xì)胞活力的影響計算丙泊酚半數(shù)致死濃度。

1.7 實驗分組

以丙泊酚半數(shù)致死濃度為實驗加藥標(biāo)準(zhǔn)濃度分組：si-NC組、si-MUC1組、Propofol組和si-MUC1+Propofol組。將轉(zhuǎn)染MUC1 siRNA的H460細(xì)胞命名為si-MUC1組，轉(zhuǎn)染siRNA Control的H460細(xì)胞命名為si-NC組，將55.96μmol/L的丙泊酚干預(yù)的H460細(xì)胞命名為Propofol組，將轉(zhuǎn)染MUC1 siRNA聯(lián)合55.96μmol/L的丙泊酚干預(yù)的H460細(xì)胞命名為si-MUC1+Propofol組。

1.8 CCK

-

8法檢測H460細(xì)胞增殖能力

對數(shù)生長期H460細(xì)胞按照上述“1.7”方法分組處理，24、48、72 h后采用CCK-8法檢測各組H460細(xì)胞吸光度值（

λ

=450 nm）。

1.9 細(xì)胞克隆形成實驗

si-NC組、si-MUC1組、Propofol組和si-MUC1+Propofol組H460細(xì)胞分別以500個/孔接種到6孔板中，將6孔板放置到37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，直至細(xì)胞克隆形成。使用4%多聚甲醛固定30 min，在使用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，洗去染液，風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個視野觀察，判斷細(xì)胞克隆形成情況并計數(shù)大于50個克隆數(shù)的集落，實驗重復(fù)3次。

1.10 Western blotting檢測各組H460細(xì)胞中PCNA、cyclin D1、Akt和p

-

Akt蛋白表達(dá)水平

分別收集處理48 h si-NC組、si-MUC1組、Propofol組和si-MUC1+Propofol組H460細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液并提取細(xì)胞中總蛋白，按照方法“1.5”檢測各組細(xì)胞中PCNA、cyclin D1、Akt和p-Akt蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 MUC1 siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌H460細(xì)胞中MUC1表達(dá)的影響

分別將MUC1特異性siRNA及陰性對照轉(zhuǎn)染至肺癌H460細(xì)胞，qPCR和Western blotting檢測結(jié)果如圖1所示，si-NC組和si-MUC1組細(xì)胞中MUC1 mRNA的表達(dá)分別為：（1.00±0.10）、（0.18±0.02），MUC1蛋白表達(dá)分別為：（0.56±0.06）、（0.21±0.02），與si-NC組比較，si-MUC1組H460細(xì)胞中MUC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（

t

=24.122，

P

＜0.001，

t

=16.602，

P

＜0.001）。提示轉(zhuǎn)染MUC1 siRNA能夠有效敲低H460細(xì)胞中MUC1基因表達(dá)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測肺癌H460細(xì)胞中黏蛋白1（MUC1）蛋白表達(dá)水平

2.2 丙泊酚對H460細(xì)胞活力的影響

采用不同濃度（0、12.5、25、50、100μmol/L）的丙泊酚干預(yù)H460細(xì)胞48 h，CCK-8檢測結(jié)果顯示，0、12.5、25、50、100μmol/L的丙泊酚干預(yù)H460細(xì)胞活力分別為（100±5.17）%、（90.26±5.22）%、（73.38±4.14）%、（50.51±3.81）%、（34.62±3.24）%，丙泊酚對H460細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用（

t

=12.879、23.943、31.630，均

P

＜0.05），且具有一定的劑量依賴性。根據(jù)丙泊酚對H460細(xì)胞活力的影響，計算丙泊酚半數(shù)致死濃度為55.96μmol/L，因此后續(xù)選取濃度為55.96μmol/L的丙泊酚作用實驗加藥濃度。

2.3 MUC1 siRNA聯(lián)合丙泊酚對H460細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實驗分析結(jié)果如表1所示，與si-NC組相比，從48 h開始si-MUC1組、Propofol組和si-MUC1+Propofol組H460細(xì)胞吸光度值明顯降低（

P

＜0.05），與si-MUC1組和Propofol組相比，從48 h開始si-MUC1+Propofol組H460細(xì)胞吸光度值顯著降低（

P

＜0.05）。提示敲低MUC1和丙泊酚均能抑制H460細(xì)胞增殖，兩者聯(lián)合對H460細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)。

表1 各處理組H460細(xì)胞在24、48和72 h時吸光度值比較/（A，±s）

2.4 MUC1 siRNA聯(lián)合丙泊酚對H460細(xì)胞克隆形成能力的影響

si-NC組、si-MUC1組、Propofol組和si-MUC1+Propofol組細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為：（163.36±8.22）個、（101.26±7.69）個、（92.64±6.88）個、（52.09±6.14）個。提示敲低MUC1和丙泊酚均能抑制H460細(xì)胞克隆形成能力，兩者聯(lián)合對H460細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用更顯著。見圖2。

圖2 克隆形成實驗檢測各組肺癌H460細(xì)胞克隆形成能力：A為si-NC組；B為si-MUC1組；C為Propofol組；D為si-MUC1+Propofol組

2.5 MUC1 siRNA聯(lián)合丙泊酚對H460細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果如圖3和表2所示，提示敲低MUC1和丙泊酚均能下調(diào)H460細(xì)胞中PCNA、cyclin D1和p-Akt蛋白表達(dá)，兩者聯(lián)合對H460細(xì)胞中PCNA、cyclin D1和p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)作用更明顯。

圖3 Western blotting檢測各組肺癌H460細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白水平

3 討論

肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高等特點，是全球最常見的腫瘤之一。目前治療肺癌的策略主要包括手術(shù)切除，以化療和放療進(jìn)行輔助的綜合治療方式，然而往往不能達(dá)到預(yù)期治療效果。因此，探索更合理、高效的聯(lián)合治療手段對肺癌的臨床治療具有十分重要的意義。報道顯示，黏蛋白（Mucin，MUC）家族中多個成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。MUC1作為MUC家族重要成員，在細(xì)胞增殖、分化、周期進(jìn)程、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。研究已證實MUC1在多種類型癌癥中表達(dá)上調(diào)，如段海章等報道指出，MUC1在膽囊癌組織中呈高表達(dá)，且MUC1的表達(dá)量與膽囊癌的浸潤程度和惡性程度呈正相關(guān)，可作為膽囊癌的腫瘤標(biāo)志物。Ma等研究顯示，LincRNAROR/miR-145在三陰性乳腺癌細(xì)胞系中的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用是通過靶向調(diào)控MUC1的表達(dá)來影響E-鈣黏蛋白膜定位實現(xiàn)的。有學(xué)者提出LINC01296/miR-26a/GALNT3軸通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)O-糖基化MUC1促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中MUC1的高表達(dá)水平與早期復(fù)發(fā)、預(yù)后不良和高轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，且MUC1敲低能夠抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染MUC1 siRNA能夠有效敲低H1650細(xì)胞中MUC1基因表達(dá)。CCK-8和克隆形成實驗結(jié)果觀察到MUC1敲低能夠抑制肺癌H1650細(xì)胞生長，這與先前的研究一致。

丙泊酚是臨床上手術(shù)常用的麻醉藥，其在腫瘤復(fù)發(fā)中的研究已得到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。研究顯示，丙泊酚在肺癌中能夠降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，且可抑制肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但目前關(guān)于MUC1 siRNA聯(lián)合丙泊酚是否協(xié)同抑制肺癌的研究仍未報道。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的丙泊酚對H460細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用，單獨敲低MUC1或丙泊酚處理均能抑制H460細(xì)胞生長；且敲低MUC1聯(lián)合丙泊酚對H460細(xì)胞生長抑制作用更顯著。此外該結(jié)論由PCNA和cyclin D1蛋白表達(dá)降低進(jìn)一步證實。PCNA是細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的良好分子標(biāo)志物，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞。cyclin D1屬于高度保守的細(xì)胞周期家族成員之一，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實驗Western blotting檢測各處理組H460細(xì)胞中PCNA和cyclin D1發(fā)現(xiàn)，敲低MUC1或丙泊酚均能夠下調(diào)PCNA和cyclin D1的表達(dá)，且兩者聯(lián)合對PCNA和cyclin D1表達(dá)抑制作用更強(qiáng)。Akt信號通路在多種腫瘤中異常激活，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過程。本研究結(jié)果顯示，敲低MUC1或丙泊酚均能夠下調(diào)p-Akt的表達(dá)，兩者聯(lián)合對p-Akt下調(diào)作用更明顯，提示敲低MUC1或丙泊酚均可抑制Akt信號通路的激活，兩者聯(lián)合對Akt信號通路抑制作用更顯著。

表2 各組肺癌H460細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)水平比較/±s

綜上，敲低MUC1基因表達(dá)和丙泊酚均能通過抑制Akt信號通路的激活抑制肺癌H460細(xì)胞生長，且兩者聯(lián)合對H460細(xì)胞生長抑制作用更強(qiáng)。本實驗結(jié)果提示基因治療聯(lián)合藥物使用在阻礙肺癌發(fā)展中可能發(fā)揮較好作用，但其適用性尚需進(jìn)一步深入探究。