微小RNA-194-5p與cullin4A在肺結(jié)核病人中的表達(dá)及意義

肺結(jié)核是臨床常見疾病之一，其主要是由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）引起的一種慢性傳染性疾病，因而早期篩查與診斷肺結(jié)核具有重要意義。研究表明Mtb感染病人發(fā)展為肺結(jié)核的風(fēng)險明顯升高，而Mtb主要存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，并可通過降低機體抗結(jié)核免疫能力從而造成結(jié)核病難以有效控制。既往研究顯示鳥苷酸結(jié)合蛋白5（Guanylate binding protein 5，GBP5）在肺結(jié)核病中表達(dá)水平升高，并可能作為早期診斷的有效指標(biāo)。但肺結(jié)核早期診斷效率并未明顯提高，因而尋找有效診斷肺結(jié)核的分子標(biāo)記物具有重要意義。微小RNA-194-5p（microRNA-194-5p，miR-194-5p）在脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)心肌細(xì)胞炎癥損傷。研究表明miR-194-5p可靶向抑制泛素連接酶cullin4A（CUL4A）表達(dá)從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但miR-194-5p與CUL4A在肺結(jié)核中的表達(dá)尚未可知。本研究通過檢測肺結(jié)核病人血清中miR-194-5p與CUL4A的表達(dá)，分析其與肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，同時通過構(gòu)建Mtb感染人單核巨噬細(xì)胞U937模型，在體外水平探究miR-194-5p與CUL4A在Mtb感染中的作用機制，探討其在肺結(jié)核發(fā)病過程中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月至2018年12月中國平煤神馬集團(tuán)職業(yè)病防治院呼吸內(nèi)科收治的結(jié)核病病人為研究對象，將確診為肺結(jié)核病人50例作為肺結(jié)核組，入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)痰涂片驗證顯示存在抗酸桿菌；所有病人均符合肺結(jié)核診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中男25例，女25例，年齡（43.25±16.32）歲。潛伏結(jié)核感染病人50例作為潛伏結(jié)核感染組，入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）篩選，IGRAs呈陽性但沒有結(jié)核病癥狀、體征、影像學(xué)等依據(jù)的病人，男26例，女24例，年齡（44.16±15.21）歲。選取同期該院體檢中心健康體檢者50例作為對照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：IGRAs呈陰性且無任何結(jié)核病臨床癥狀，男30例，女20例，年齡（45.18±13.24）歲。三組受試者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1

主要試劑與儀器 人單核細(xì)胞系U937購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；Mtb購自美國ATCC公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸緩沖液（PBS）購自美國賽默飛世爾科技公司；乙醇、氯仿、異丙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）所需試劑均購自武漢華美生物工程有限公司；可溶性Tim-3（sTim-3）與可溶性Gal-9（sGal-9）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒購自美國RD公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）與Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；兔抗人T細(xì)胞因子（TCF）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）、β-連環(huán)素（βcatenin）抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；普通PCR儀購自美國賽默飛世爾科技公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2.2

感染模型的建立U937細(xì)胞培養(yǎng)于含有血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度1×10個/毫升，接種于12孔板（200微升/孔），加入佛波酯（PMA）孵育48 h，待細(xì)胞貼壁生長且聚集成串即細(xì)分化為成熟單核-巨噬細(xì)胞。將成熟的U937細(xì)胞接種于24孔板，采用Mtb感染復(fù)數(shù)方法感染細(xì)胞，孵育4 h，PBS洗滌，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，分別記作NC組（未經(jīng)處理的U937細(xì)胞）、Mtb組（Mtb感染的U937細(xì)胞），收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測miR-194-5p、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol法提取血清與各組U937細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA）。miR-194-5p正向引物5"-ATGTGGACTGTGCTCGGATT-3"，反向引物5"-ACTCGATCAGCT AGCTTACGA-3"；CUL4A正向引物5"-CTACTGGCCAACATACACGC-3"，反向引物5"-AAG CCATCTCCCTCGTTGAA-3"；GBP5正向引物5"-GATCCACATGTCAGACCCCA-3"，反向引物5"-GCACCGTAGATGCAACAGAG-3"；U6正向引物5"-GCTTCGGC AGCACATA TACT-3"，反向引物5"-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3"；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物5"-AACG GATTTGGTCGTATTG-3"，反向引物5"-GGAAGATGGTGATGGGATT-3"，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，cDNA 2μL，正反向引物各0.8μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，雙 蒸 水（ddHO）6μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。miR-194-5p以U6為內(nèi)參，CUL4A、GBP5以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計算miR-194-5p、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4

ELISA檢測血清中細(xì)胞因子水平 采用ELISA檢測各組受試者血清中sTim-3、sGal-9的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5

ELISA實驗檢測U937細(xì)胞中炎性因子水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測各組U937細(xì)胞中炎性因子IL-6、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6

Western blotting檢 測TCF、GSK-3β、βcatenin蛋白表達(dá) 收集各組U937細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上孵育30 min，離心后提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液（1∶2 000），室溫條件下孵育1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組病人血清中miR

-

194

-

5p、CUL4A mRNA的表達(dá)水平比較

與對照組相比，潛伏結(jié)核感染組與肺結(jié)核組病人血清miR-194-5p的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），CUL4A mRNA的表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）；與潛伏結(jié)核感染組相比，肺結(jié)核組病人血清miR-194-5p的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），CUL4A mRNA的表達(dá)水平降低（

P

＜0.05），詳見表1。

2.2 各組病人血清中GBP5與細(xì)胞因子水平比較

與對照組相比，潛伏結(jié)核感染組與肺結(jié)核組病人血清中GBP5 mRNA的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），sTim-3、sGal-9水平升高（

P

＜0.05）；與潛伏結(jié)核感染組相比，肺結(jié)核組病人血清中GBP5 mRNA的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），sTim-3、sGal-9水平升高（

P

＜0.05），詳見表2。

表1 健康體檢對照與肺結(jié)核血清中miR-194-5p、CUL4A mRNA的表達(dá)水平比較/±s

表2 健康體檢對照與肺結(jié)核血清中GBP5與細(xì)胞因子水平比較/±s

2.3 肺結(jié)核病人miR

-

194

-

5p、CUL4A表達(dá)量與GBP5、sTim

-

3、sGal

-

9的相關(guān)性分析

miR-194-5p與GBP5、sTim-3、sGal-9呈正相關(guān)，CUL4A與GBP5、sTim-3、sGal-9呈負(fù)相關(guān)，miR-194-5p與CUL4A呈負(fù)相關(guān)，均有

P

＜0.001。相關(guān)結(jié)果見表3。

2.4 巨噬細(xì)胞感染Mtb后miR

-

194

-

5p、CUL4A表達(dá)量與炎性因子IL

-

6、TNF

-α

水平比較

與NC組相比，Mtb組細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），CUL4A mRNA的表達(dá)水平降低（

P

＜0.05），IL-6、TNF-α的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），見表4。

2.5 巨噬細(xì)胞感染Mtb后Wnt/

β-

catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

與NC組相比，Mtb組細(xì)胞中TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)量升高（

P

＜0.05），見圖1、表5。

表4 巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌（Mtb）后miR-194-5p、CUL4A表達(dá)量與炎性因子IL-6、TNF-α水平比較/±s

圖1 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白免疫印跡圖

表5 巨噬細(xì)胞感染Mtb后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較/±s

3 討論

目前肺結(jié)核診斷準(zhǔn)確率較低，誤診率較高，不同病人對抗結(jié)核藥物的敏感性不同，因而尋找用于肺結(jié)核診斷的生物學(xué)標(biāo)記物具有重要意義。研究表明肺結(jié)核病人外周血中非編碼RNA表達(dá)異常并可能參與疾病發(fā)生及發(fā)展過程。因而本研究積極探尋新型miRNA分子并分析其在肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

表3 肺結(jié)核50例miR-194-5p、CUL4A表達(dá)量與GBP5、sTim-3、sGal-9的相關(guān)性分析結(jié)果（r值，P值）

既往研究顯示miR-194-5p可通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)素（Wnt/β-catenin）信號通路從而參與乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。CUL4A在慢性阻塞性肺疾病病人中表達(dá)異常并可參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示miR-194-5p在肺結(jié)核病人中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量高于潛伏結(jié)核病病人，而CUL4A的表達(dá)量明顯降低，說明miR-194-5p表達(dá)量升高與CUL4A表達(dá)量降低可能促進(jìn)肺結(jié)核的發(fā)生及發(fā)展。GBP5在炎性反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)并可參與肺結(jié)核發(fā)生過程，研究表明sTim-3、sGal-9屬于免疫負(fù)調(diào)控基因，并可促進(jìn)炎性因子分泌。與上述研究相似，本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核病人血清中GBP5 mRNA的表達(dá)水平升高，sTim-3、sGal-9水平升高，提示肺結(jié)核病人體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。本研究分析肺結(jié)核病人miR-194-5p、CUL4A表達(dá)量與GBP5、sTim-3、sGal-9的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-194-5p與CUL4A呈負(fù)相關(guān)，miR-194-5p與GBP5、sTim-3、sGal-9呈正相關(guān)，CUL4A與GBP5、sTim-3、sGal-9呈負(fù)相關(guān)，說明miR-194-5p與CUL4A可反映肺結(jié)核的炎癥嚴(yán)重程度。提示miR-194-5p表達(dá)量升高可能通過抑制CUL4A表達(dá)從而促進(jìn)肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展。

Wnt/β-catenin信號通路激活后可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。研究表明肺結(jié)核病人中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白TCF、GSK-3β、β-catenin表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)疾病發(fā)展進(jìn)程，Wnt/β-catenin信號通路激活與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示Mtb感染細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)水平升高，CUL4A的表達(dá)水平顯著降低，IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示Mtb感染細(xì)胞中TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)量升高，說明Wnt/β-catenin信號通路激活可加重巨噬細(xì)胞炎癥損傷。提示miR-194-5p表達(dá)量升高可能通過下調(diào)CUL4A表達(dá)而抑制Mtb感染引起的炎癥反應(yīng)，其作用機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活而發(fā)揮作用。

綜上所述，肺結(jié)核病人血清中miR-194-5p表達(dá)升高，CUL4A表達(dá)降低，二者表達(dá)量與結(jié)核病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并可能作為早期診斷肺結(jié)核的有效指標(biāo)，結(jié)核菌感染可上調(diào)miR-194-5p表達(dá)及下調(diào)CUL4A表達(dá)，并可激活Wnt/β-catenin信號通路。