神經纖毛蛋白1和血管內皮生長因子受體2在肝細胞癌組織中的表達和臨床意義

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，它是全球 導致癌癥死亡的第二大原因。全球每年新增肝癌病例782 500例，死亡745 500例，僅中國就占總病例和死亡人數的50%左右。其中肝細胞癌占原發性肝癌的85%～90%。目前，手術切除和肝移植是唯一可能治愈的策略，但在根治性切除后，尤其是在殘余肝中，復發率仍然很高，約80%病人在診斷時已為腫瘤晚期，中位生存期約為8個月，其預后普遍令人沮喪。近年來，人們對其侵襲和轉移的分子機制進行了大量的研究，但有關肝細胞癌惡性和轉移的詳細機制尚不明確，因此，識別肝細胞癌可靠的腫瘤分子生物標記物對于個性化治療和評估預后至關重要。神經纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP-1）最初被描述為對神經元發育具有重要作用的信號受體，同時很多研究發現，NRP-1在許多癌癥的血管生成和惡性進展中起重要作用，如：乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、黑素瘤和胰腺癌等。但它在肝細胞癌方面的相關研究鮮見報道，因此，本研究通過應用免疫組織化學法檢測肝細胞癌組織及癌周正常肝組織的NRP-1、血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）表達情況，探討NRP-l、VEGFR2在肝細胞癌的表達與臨床病理特征、預后的關系，為肝細胞癌的診治、預后評估提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年11月至2018年11月徐州醫科大學附屬醫院肝膽外科行手術切除并經病理學確診為肝細胞癌的石蠟包埋標本共40例，并獲得20例癌旁正常肝組織標本，均有完整的臨床資料。所有病人術前未接受任何抗腫瘤治療，且經影像學檢查排除遠處轉移。男性25例，女性15例；中位年齡60歲；有慢性肝炎病毒感染26例，無慢性肝炎病毒感染14例；合并肝硬化26例，未合并肝硬化14例；Child-Pugh分級A級29例、B級11例。病理分級高分化8例，中分化21例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期22例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。對所有病人進行至少為期1年的隨訪，記錄病人術后1年復發情況，末次隨訪時間為2019年11月。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

主要試劑包括購自美國的affinity公司的兔抗人NRP-1單克隆抗體，購自美國的proteintech公司的兔抗人VEGFR2單克隆抗體，購自福州邁新生物科技有限公司的兔SP免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑。將40例肝細胞癌組織及20例正常肝組織標本蠟塊制備成4μm厚連續切片，60℃烤片2 h，行NRP-1和VEGFR2免疫組化染色。

1.3 判定標準

顯微鏡下觀察組織細胞中NRP-1和VEGFR2蛋白的表達情況，選取3個高表達區域拍照保存（所有圖片均400×拍攝），使用Image-Pro Plus圖像分析軟件對免疫組化圖片進行處理，計算平均光密度（average optical density，AOD）。

1.4 統計學方法

采用SPSS Statistics 22.0軟件對數據進行統計學分析，使用Shapiro-Wilk（W檢驗）判斷數據是否服從正態分布。NRP-1和VEGFR2在肝細胞癌和癌旁正常肝組織的表達及與各臨床病理參數之間的關系采用兩獨立樣本

t

檢驗。NRP-1和VEGFR2的表達的相關性采用Pearson相關分析。NRP-1和VEGFR2的表達高低與病人術后復發關系采用

χ

檢驗。檢驗水準

α

＝0.05。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織及正常肝組織的NRP

-

1、VEGFR2的表達情況

免疫組化結果顯示，NRP-1和VEGFR2主要表達在腫瘤細胞和血管內皮細胞的細胞質和細胞膜上（圖1）。NRP-1、VEGFR2在肝細胞癌組織中AOD分別為（0.398±0.051）、（0.454±0.058），在正常肝組織中的AOD分別為（0.244±0.095）、（0.337±0.064），經

t

檢驗分析NRP-1、VEGFR2在肝細胞癌組織和正常肝組織中的表達差異有統計學意義（

t

=6.815，

P

＜0.001；

t

=7.155，

P

＜0.001）。

2.2 NRP

-

1、VEGFR2的表達與肝細胞癌臨床病理特征的關系

肝細胞癌組織的NRP-1、VEGFR2的表達水平與病人性別、年齡、有無慢性肝炎病毒感染、甲胎蛋白水平、腫瘤數目、有無肝硬化、Child-Pugh分級無明顯相關性（均

P

＞0.0

5

）；而與病人腫瘤的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期有關（均

P

＜0.05）。見表1。

2.3 肝細胞癌組織中NRP

-

1與VEGFR2的相關性分析

Pearson相關分析顯示，NRP-1和VEGFR2在肝細胞癌組織中的表達存在正相關（

r

=0.789，

P

＜0.001）。

2.4 肝細胞癌組織中NRP

-

1、VEGFR2的表達與病人術后復發關系分析

根據NRP-1、VEGFR2各自的算術平均數分為高、低表達組，肝細胞癌組織中NRP-1、VEGFR2低表達組術后1年復發率［5.56%（1/18）、20.00%（4/20）］明顯低于NRP-1、VEGFR2高表達組［63.64%（14/22）、55.00%（11/20）］（

χ

=14.249，

P

＜0.001；

χ

=5.227，

P

=0.022）。

3 討論

肝細胞癌是一種富血供腫瘤，它的發生、進展與新生腫瘤血管的生成有密切關系。血管生成是腫瘤進展的重要組成部分。新血管的生成為細胞增殖提供氧氣和營養，同時去除二氧化碳和代謝廢物。不僅支持了惡性腫瘤的快速生長，而且通過提供一條逃逸到身體中遠部位的路徑，增加腫瘤的轉移潛力。血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）是其中一個關鍵的促血管生成信號分子，它主要通過與VEGFR2的相互作用來促進細胞增殖、遷移、骨架重組、分化和新脈管系統的形成及動員內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）從骨髓進入外周循環。VEGF的過度表達與多種腫瘤的進展和預后不良有關，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。本研究檢測了肝細胞癌組織中VEGFR2的表達情況，結果顯示與正常肝組織細胞相比，肝細胞癌組織中VEGFR2的表達明顯升高，這與在其他惡性腫瘤的表達相符。同時我們進一步分析了VEGFR2的表達與肝細胞癌病人的臨床病理特征及復發情況的關系，發現它與腫瘤組織的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期明顯相關，VEGFR2高表達的肝細胞癌病人組術后1年復發率明顯高于VEGFR2低表達的肝細胞癌病人組，這表明VEGFR2的表達與腫瘤的增殖、侵襲性有關，并可作為臨床判斷肝細胞癌預后的指標之一。

表1 NRP-1、VEGFR2的表達與40例肝細胞癌病人臨床病理參數的關系/±s

NRP-1是I型跨膜糖蛋白，可以促進腫瘤發生的各個方面，如血管生成、細胞存活、遷移、侵襲和化療耐藥。NRP-1參與腫瘤進展的機制，主要與腫瘤血管生成有關，這與其通過表達在腫瘤內皮細胞中的VEGFR2增強VEGF介導的信號傳導的相關。NRP-1還被證明介導了依賴血小板衍生生長因子B（platelet derived growth factor B，PDGF-B）的間充質干細胞-周細胞的轉變和募集。這兩個事件在腫瘤血管重構和轉移擴散中起著重要作用。此外，NRP-1能結合幾種促血管生成細胞因子，并能放大肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導的促血管生成的刺激信號，而且已經在膠質瘤、胰腺癌和前列腺癌等中得到證實。本研究結果顯示NRP-1在肝細胞癌組織中高表達，在正常肝組織中低表達或不表達，這與其他研究相一致，這些結果提示NRP-1表達與正常組織的惡性轉化有關。更重要的是，我們還發現它與腫瘤組織的最大徑、分化程度、TNM分期明顯相關。與NRP-1低表達的病人相比，NRP-1高表達的病人的顯示不良的預后，這表明NRP-1可以作為肝細胞癌病人的一種新的預后生物標志物。本研究結果與前期王金爽、楊麗報告的其在NSCLC的作用相類似。

我們還檢測了肝細胞癌中NRP-1與VEGFR2的相關性，兩者成正相關（

r

=0.789，

P

＜0.001），而VEGFR2對腫瘤血管生成、促進內皮細胞增殖和增加血管通透性至關重要，因此，NRP-1可能通過促進肝細胞癌中的VEGFR2表達來促進血管生成。有研究發現NRP-1是一種共受體來介導VEGFR2的活性，可增強VEGF與VEGFR2的結合，從而促進內皮細胞中的VEGF介導的下游信號通路。也有研究表明NRP-1不僅促進VEGFR2信號轉導、內吞作用、信號輸出，還可促進VEGFR2非依賴性的VEGF-A信號轉導、整合素介導的纖維連接蛋白組裝和基質黏附。本研究進一步地支持了他們的觀點。

目前，阻斷血管生成已成為一種突出的策略，以補充化療方法來治療癌癥。雖然兩項大型國際多中心Ⅲ期臨床試驗均充分證明了索拉非尼對晚期肝細胞癌有一定的生成獲益，但仍不能令人滿意。最近，一種人IgG單克隆抗體被開發出來，阻斷位于VEGF結合位點的NRP-1 B1B2結構域，值得注意的是，該抗體阻斷了血管生成和血管重塑。因此，NRP-1可以作為潛在的血管生成靶點。

總之，本研究結果提示NRP-1、VEGFR2的高表達與肝細胞癌的發生、發展有關，可以作為判斷肝細胞癌病人預后的分子標志。同時針對NRP-1的靶向藥物正在研制中，NRP-1有望成為一個新的治療靶點。由于本研究的樣本量較少，隨訪時間較短，無法得出NPR-1、VEGFR2的表達與總生存期的關系，因此需要繼續隨訪病例，并進一步擴大樣本量進行驗證。