肝細胞生長因子/酪氨酸蛋白激酶MET信號通路與乳腺癌侵襲轉移的相關性分析

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，約有24%～60%的乳腺癌病人因為腫瘤轉移而死亡。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）也被稱為擴散因子，是具有促有絲分裂的一種獨特的生長因子。HCF由間充質細胞所分泌，其受體酪氨酸蛋白激酶MET（c-met）蛋白作為一種闊膜蛋白，存在于多種上皮細胞膜上。當HCF與c-met蛋白發生特異性結合，導致c-met蛋白酪氨酸激酶活性的激活，從而使該通路上多種底物蛋白發生磷酸化，從而調控細胞的增殖和分化。本研究探討分析HGF/c-met信號通路與乳腺癌侵襲轉移的相關性，為了闡明乳腺癌發生發展提供依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月至2019年3月承德醫學院附屬醫院臨床術后經病理證實的乳腺癌標本75例、乳腺纖維腺瘤標本60例以及癌旁正常乳腺組織標本50例。乳腺癌病理類型均為浸潤性導管癌，正常乳腺組織取自乳腺癌根治術后標本距離腫瘤（或腫瘤結節）邊緣大于5 cm的區域。75例乳腺癌病人均為女性，年齡（51.93±7.32）歲，范圍為33～76歲，其中左乳腺39例、右乳腺36例，腫瘤直徑≥2 cm病人33例、＜2 cm病人42例；TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期25例、Ⅲ期19例、Ⅳ期10例；其中伴有淋巴結轉移病人35例、無淋巴結轉移病人40例。

1.2 方法

1.2.1

SP免疫組化法 石蠟包埋連續切片4μm，3%過氧化氫孵育10 min封閉滅活內源性過氧化物酶；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 min后將切片放入0.01 mL/L枸櫞酸緩沖液中微波抗原修復10 min；加入山羊血清封閉60 min（37℃），滴加適當濃度的一抗，37℃孵育60 min后4℃過夜，PBS洗5 min×3；滴加羊抗兔/鼠IgG二抗，室溫孵育15 min，PBS洗5 min×3；3，3"-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木素復染核，封片、觀察。使用PBS代替一抗作為陰性對照。

HGF、c-met判斷標準：HGF、c-met以正常黏膜上皮細胞或腫瘤細胞質或胞核出現棕黃色顆粒為陽性，陽性表達判斷標準：①選取染色均勻的組織區域，在400倍視野下計數著色細胞占視野總細胞的百分數，共隨機計數5個視野，取其平均值，按照百分數記分，0分：0%；1分：＞0%～25%；2分：＞25%～50%；3分：＞50%。②按照細胞著色強弱程度評分：0分：不著色；1分：著色弱；2分：中等著色；3分：著色強。按照①、②值之和判斷結果，0分：陰性（-）；1～2分：弱陽性（+）；3～4分：中等陽性（++）；5～6分：強陽性（+++）。

β連環素（β-catenin）判斷標準：β-catenin在細胞膜、細胞質、細胞核3個部位表達強度進行判斷，正常β-catenin表達主要定位于細胞膜，當＞70%細胞膜陽性表達為正常表達，反之為細胞膜表達缺失；當＞10%細胞質或細胞核陽性表達為異位表達。將細胞膜表達缺失以及異位表達均作為異常表達。

1.2.2

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測方法取100 mg組織（液氮中保存）放入勻漿器中，在冰浴條件下將組織剪碎后立即加入預冷的Trizol提取液1 mL，充分勻漿，根據試劑使用說明提取組織RNA，使用紫外分光光度計定量RNA含量。參照文獻設計引物，PCR擴增反應條件為：94℃預變性2 min，94℃45 s、55℃30 s、72℃30 s，共進行35個循環，72℃8 min。將PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后使用凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描，用目的基因吸光度與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）吸光度比值表示目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 三種組織中各蛋白免疫組化表達情況

HGF、c-met、β-catenin在乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織以及癌旁正常乳腺組織中的表達均差異有統計學意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 不同乳腺組織樣本中各蛋白免疫組化表達情況比較

2.2 三種組織中HGF、c

-

met、

β-

catenin mRNA相對表達情況

在乳腺癌、乳腺纖維腺瘤及癌旁正常乳腺組織中HGF、c-met mRNA相對表達量差異有統計學意義（

P

＜0.05），其中乳腺癌最高、乳腺纖維腺瘤次之；而乳腺癌、乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織中β-catenin mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表2、圖1。

表2 三種乳腺組織中HGF、c-met、β-catenin mRNA相對表達情況/±s

2.3 HGF表達與乳腺癌病人病理相關性分析

HGF表達陽性率與病人TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小、ER表達、HER-2表達有關（

P

＜0.05）；c-met蛋白表達陽性率與病人TNM分期、淋巴結轉移密切相關（

P

＜0.05）；β-catenin蛋白表達異常率與病人TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小密切相關（

P

＜0.05）。見表3。

3 討論

圖1 PCR顯示HGF、c-met及β-catenin在75例乳腺癌組織中的表達

目前乳腺癌治療靶點的研究仍處于起步階段。HGF可以促進腫瘤細胞的增殖與轉移，同時還可促進腫瘤組織周圍血管以及淋巴管的形成，從而為腫瘤轉移提供通道，對腫瘤的轉移可能具有促進作用，并可能與乳腺癌惡變程度有關。HGF由間充質細胞所分泌，其受體c-met蛋白作為一種跨膜蛋白，在多種上皮細胞膜上均有表達。當HGF與c-met蛋白發生特異性結合之后，可激活cmet受體蛋白的酪氨酸激酶活性，調控腫瘤細胞的增殖與分化。β-catenin是一種重要的胞內蛋白，是具有癌基因潛能的轉錄激活蛋白，同時也是配體蛋白（Wnt）/連環蛋白（Catenin）信號通路中的一種信號轉導分子，是細胞間重要的黏附分子之一，在腫瘤發生、發展、侵襲以及遷移過程中具有著重要作用。研究顯示，HGF/c-met介導的信號通路可促使Wnt/Catenin信號通路傳導分子β-catenin酪氨酸殘基發生磷酸化，使β-catenin不能與上皮鈣黏素胞內部分結合形成復合體，從而降低細胞間黏附作用，而影響腫瘤組織的侵襲和遷移。

表3 HGF、c-met、β-catenin表達與乳腺癌病人75例臨床病理相關性分析/例（%）

本研究結果顯示，在乳腺癌組織中，HGF、c-met蛋白表達陽性率顯著高于乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織，而β-catenin蛋白表達異常率（包括細胞膜表達缺失以及異位表達）顯著高于乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織。與學者相關研究結果相似，提示在乳腺癌中，HGF/c-met信號通路處于高表達狀態，且β-catenin異常表達明顯升高。此外，RT-PCR結果顯示，HGF、c-met mRNA相對表達量在乳腺癌組織中最高，乳腺纖維腺瘤次之，進一步證實了HGF、c-met在乳腺癌組織中的高表達；而β-catenin mRNA在三種不同組織中的相對表達含量無明顯差異，可能考慮β-catenin在正常組織中均有表達，而在乳腺癌組織中出現表現為表達異常，通過RT-PCR法僅代表mRNA表達相對含量，而無法定位具體表達部位。

此外，本研究結果顯示，HGF表達陽性率與病人TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小、ER表達、HER-2表達有關（

P

＜0.05）；c-met蛋白表達陽性率與病人TNM分期、淋巴結轉移密切相關（

P

＜0.05）；βcatenin蛋白表達異常率與病人TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小密切相關（

P

＜0.05）。HGF、c-met、βcatenin蛋白與乳腺癌疾病進展、腫瘤侵襲轉移具有著密切的聯系，其中HGF蛋白表達與ER表達、HER-2表達有關，提示HGF/c-met信號通路、βcatenin蛋白可能為乳腺癌侵襲轉移的調控機制之一，還需進一步深入研究分析。

綜上所述，乳腺癌組織中HGF、c-met蛋白高表達而β-catenin蛋白異常表達，且HGF/c-met信號通路及β-catenin蛋白與乳腺癌侵襲轉移密切相關。