微小RNA-211在顱內動脈瘤中差異表達及其對血管平滑肌細胞凋亡影響

顱內動脈瘤是臨床上常見的腦血管疾病之一，其具有極高的致死率和致殘率，顱內動脈瘤也是自發性蛛網膜下腔出血發生的重要原因。大量研究顯示，顱內動脈瘤的發生與血流動力學、后天退行性病變、遺傳學等多種因素有關，血管平滑肌細胞凋亡是后天退行性病變中引發顱內動脈瘤的關鍵之一。血管平滑肌細胞具有維持血管平衡及穩定的作用，而血管平滑肌細胞過度凋亡導致血管壁的張力下降，誘導顱內動脈瘤發生。微小RNA（miRNA）是在真核生命體內存在、具有多種生物學作用的調控子，其在人類正常生理進程以及疾病發生中發揮諸多功能。miRNA參與心腦血管疾病發生，與腦缺血再灌注、高血壓、動脈粥樣硬化等有關，miRNA有望成為治療和診斷心腦血管疾病的小分子標志物。微小RNA-211（miR-211）參與腫瘤細胞、缺氧心肌細胞等多種細胞的凋亡過程，miR-211在不同的組織或疾病進展中的調控作用不同。本次實驗初步探討miR-211在顱內動脈瘤中的表達變化及其對血管平滑肌細胞凋亡的影響，以期為顱內動脈瘤的治療提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年5月至2019年1月成都醫學院第一附屬醫院手術切除的顱內動脈瘤組織50例，同時選取同期該院20例正常顱內動脈血管組織，正常顱內動脈血管組織采集自顱腦外傷病人。標本采集均經過病人和近親屬同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。miRNA熒光定量PCR試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit、miRNA逆轉錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit購自德國QIAGEN；互補DNA（cDNA）合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo；熒光定量PCR試劑盒SYBR Real-Time PCR Kit購自上海吉瑪制藥技術有限公司；模擬物陰性對照（mimics control）、miR-211模擬物（miR-211 mimics）由紐赫生物科技（上海）有限公司合成；B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）抗體購自北京義翹神州科技有限公司。

1.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）方法測定顱內動脈瘤中miR

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211、Bax表達差異

取動脈瘤組織和正常顱內動脈血管組織，添加Trizol試劑提取細胞中的總RNA，取1μL的RNA用于檢測濃度和純度。分別用miScript Reverse Transcription Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄合成cDNA，用miScript SYBR Green PCR Kit、SYBR Real-Time PCR Kit進行定量PCR。miR-211內參為U6，Bax內參為β-肌動蛋白（β-actin）。引物序列如下：miR-211正向5，-CTGCTTGGACCTGTGACCTGT-3"，反向5，-TCTGCAGTAGAGGTGACCA-3"；U6正向5，-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3"，反 向5，-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；Bax正向5，-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3"，反向5，-GCCACGTGGGCGTCCCAAAGT-3"；β-actin正向5，-GGACCTGACTGACTACCTC-3"，反向5，-TACTCCTGCTTGCTGAT-3"。根據反應的Ct值分析目的基因表達變化，計算方法為2法。

1.3 動脈瘤血管平滑肌細胞分離培養

取動脈瘤組織，用眼科剪小心將組織剪碎成1 cm×1 cm×1 cm的組織塊，添加Ⅱ型膠原酶（0.1%），置于37℃充分消化，觀察組織塊表面有白色絮狀物出現時將組織塊取出，再用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，轉移到細胞培養瓶內，組織塊之間間隔4 cm，置于37℃，5%二氧化碳培養箱中培養。8 h后，取出培養瓶，添加10%胎牛血清的DMEM培養基細胞培養液繼續培養24 h。觀察細胞爬出組織塊后的第5天，將組織塊棄掉，繼續加入細胞培養液3 mL，細胞生長密度為90%時進行傳代培養，期間每隔1天換液1次，傳代培養細胞消化液用0.25%的胰蛋白酶。分離培養的細胞經過免疫熒光鑒定為血管平滑肌細胞。

1.4 細胞轉染

血管平滑肌細胞分成Control、miRNC、miR-211共3組，其中miR-NC、miR-211組分別為轉染mimics control、miR-211 mimics后的血管平滑肌細胞，Control為空白對照細胞。細胞轉染方法簡述如下：取生長狀態較好的血管平滑肌細胞，接種到6孔板中，每孔接種2×10個細胞，觀察細胞融合度為70%時可以進行細胞轉染。吸取250μL的DMEM將mimics control、miR-211 mimics以及5μL的Lipofectamin 2000轉染試劑稀釋，然后將上述兩種稀釋溶液混合，總體積一共為500μL，置于室溫中靜置20 min。添加上述混合溶液加入到6孔板中，輕輕晃動培養板，培養6 h后，更換細胞培養液，培養24 h后收集細胞用于后續實驗。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡

取培養2 d以后的Control、miR-NC、miR-211組細胞，用0.25%的胰蛋白酶將細胞消化成單細胞懸浮液，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液將細胞洗滌2次。收集5×10個細胞，添加結合緩沖液溶液400μL，然后加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）溶液5μL，混合均勻以后，放在4℃避光條件孵育15 min；再加入碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）溶液10μL，同樣在4℃避光條件孵育15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.6 miR

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211靶基因預測和鑒定

生物信息學數據庫TargetScan顯示，miR-211和Bax的3"非翻譯區（UTR）端有互補結合位點。分別將野生型（wt）-Bax、突變型（mut）-Bax與miR-211 mimics、mimics control共轉染到血管平滑肌細胞中，培養2 d后，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組細胞熒光素酶活性變化。wt-Bax、mut-Bax分別為含有Bax的3"UTR端、含有突變后Bax的3"UTR端的熒光素酶報告載體，熒光素酶報告載體均由吉滿生物科技（上海）有限公司構建。

1.7 蛋白質印跡法（Western blotting）測定Bax蛋白表達

收集培養2 d后的Control、miR-NC、miR-211組細胞，在細胞中添加PBS溶液將細胞洗滌2次，加入苯甲基磺酞氟（PMSF）濃度為1 mmol/L的蛋白裂解試劑，以移液槍將細胞反復吹打混合后，用細胞刮刀將細胞從培養皿的底部刮下，放在冰上孵育20 min。14 000 g離心15 min，吸取上清，添加1/4體積的上樣緩沖液，在沸水浴中孵育5 min。分別配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，每個孔中添加30μg的蛋白樣品，在濃縮膠中采用75 V的電壓電泳，在分離膠中采用100 V電壓電泳。將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪成合適大小，以恒流300 mA轉膜60 min。把PVDF膜放在配制好的5%脫脂奶粉溶液中浸泡2 h。然后將PVDF膜置于含有1∶600稀釋的二抗反應液中，于4℃環境中結合過夜。最后把PVDF膜放在1∶2 000稀釋的二抗反應液中，在室溫中孵育2 h。用電化學發光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）顯色，分析條帶的灰度值。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，分析Bax蛋白表達水平。

1.8 上調Bax對miR

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211影響血管平滑肌細胞凋亡作用

將miR-211 mimics分別與Bax過表達載體（pcDNA3.1-Bax）、陰性對照載體（pcDNA3.1）共轉染到血管平滑肌細胞中，記為miR-211+Bax、miR-211+NC組，按照上述流式細胞術、Western blotting測定細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平。pcDNA3.1-Bax為Bax過表達載體，由基爾頓生物科技（上海）有限公司構建合成。

2 結果

2.1 顱內動脈瘤中miR

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211、Bax表達水平呈負相關

顱內動脈瘤中miR-211表達水平低于正常顱內動脈血管［（0.59±0.03）比（1.74±0.10），

t

=14.13，

P

＜0.001］；顱內動脈瘤中Bax mRNA表達水平高于正常顱內動脈血管［（1.25±0.05）比（0.45±0.04），

t

=9.77，

P

＜0.001］；顱內動脈瘤中miR-211表達水平與Bax mRNA表達水平呈負相關（

r

=-0.646，

P

＜0.001）。miR-211在顱內動脈瘤中低表達，Bax在顱內動脈瘤中高表達。

2.2 miR

-

211 mimics抑制血管平滑肌細胞凋亡影響

與miR-NC組比較，miR-211組血管平滑肌細胞中miR-211表達水平升高，細胞凋亡率降低（

P

＜0.05，圖1、表1）。miR-211 mimics抑制血管平滑肌細胞凋亡。

2.3 miR

-

211和Bax靶向調控作用

miR-211和Bax的3"UTR端有互補結合位點，并且miR-211 mimics和wt-Bax共轉染后細胞熒光素酶活性降低（

P

＜0.05，圖2、表2）。miR-211和Bax互為靶向關系。

圖2 miR-211和B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）的3"非翻譯區（UTR）端結合位點

表1 miR-211 mimics轉染后顱內動脈瘤血管平滑肌細胞中miR-211水平和細胞凋亡率比較/±s

表2 野生型（wt）、突變型（mut）轉染后顱內動脈瘤血管平滑肌細胞熒光素酶活性比較/±s

2.4 上調miR

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211抑制血管平滑肌細胞中Bax表達

miR-211 mimics轉染后顱內動脈瘤血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達水平分別為Control組（0.86±0.09）、miR-NC組（0.88±0.07）、miR-211組（0.45±0.06）（

F

=31.934，

P

=0.001）；與miR-NC組比較，miR-211組血管平滑肌細胞中Bax蛋白水平降低（

P

＜0.05，圖3）。上調miR-211抑制血管平滑肌細胞中Bax表達。

圖3 Western blotting檢測miR-211 mimics對顱內動脈瘤血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達影響

2.5 Bax逆轉miR

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211對血管平滑肌細胞凋亡影響

與miR-211+NC組比較，miR-211+Bax組血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達水平升高，細胞凋亡率升高（

P

＜0.05，圖4、表3）。Bax逆轉miR-211對血管平滑肌細胞凋亡影響。

3 討論

miRNA是真核生物體內固有的非編碼小分子RNA，其在生物體中能夠轉錄后調控靶基因的表達，影響下游信號轉導、蛋白表達。miRNA在進化上高度保守，在數量、表達、結構、序列上具有多樣性，miRNA在細胞分化、組織代謝、胚胎發育等過程中發揮強大功能。研究報道顯示，miRNA參與腫瘤、心腦血管系統疾病、免疫相關疾病等進展，這些miRNA在疾病發生時表達改變，并且通過調控細胞凋亡等生物學行為影響疾病進程。miR-211參與腫瘤、心腦血管疾病發生，miR-211通過不同的作用機制影響細胞凋亡。本次實驗表明，miR-211在顱內動脈瘤中表達下調，miR-211可能參與顱內動脈瘤發生。

表3 pcDNA3.1-Bax和miR-211 mimics共轉染后顱內動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡率和B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）蛋白表達水平比較/±s

細胞凋亡是機體經過內源性DNA內切酶激活，通過一系列的調控作用而誘發的結束細胞生命的復雜過程。正常情況下，血管平滑肌細胞凋亡是維持血管平衡的重要原因，血管平滑肌細胞過度凋亡能夠降低血管壁承受的張力。研究顯示，在顱內動脈瘤組織中發現血管平滑肌細胞過度凋亡，并且動脈瘤破裂的血管平滑肌細胞凋亡率高于未破裂組，血管平滑肌細胞凋亡水平增加不僅是誘導顱內動脈瘤發生的重要原因，也是誘導顱內動脈瘤破裂的重要原因。本次實驗顯示，上調miR-211后的顱內動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡水平降低，提示miR-211可能具有抗顱內動脈瘤發生的作用。

miRNA生物學功能多樣與其獨特的調控機制有關，其可以結合到靶mRNA的3"UTR端而抑制其翻譯，并且miRNA在不同的組織或病理、生理進程中的靶基因可能不同。miR-211作用廣泛，目前已經在多種組織中發現多個靶基因，miR-211參與宮頸癌進展與靶向調控SPARC有關，miR-211參與胃癌進展與SOX4有關，而miR-211調控心肌細胞凋亡則與靶向調控Sirt1有關。本次實驗表明，miR-211可以靶向負調控血管平滑肌細胞中Bax表達。Bax是一個與細胞凋亡有關的調控蛋白，其屬于Bcl-2蛋白家族成員，Bax在細胞凋亡過程中發揮促進作用。本次實驗顯示，Bax在顱內動脈瘤組織中的表達水平升高，并且Bax表達水平與miR-211水平負相關，上調Bax可以逆轉miR-211對血管平滑肌細胞凋亡的抑制作用，這充分證實，miR-211通過靶向調控Bax表達減少顱內動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡。

以上表明，miR-211在顱內動脈瘤中低表達，上調其表達可以靶向抑制Bax表達減少血管平滑肌細胞凋亡，miR-211在顱內動脈瘤發生過程中可能發揮抑制作用，目前對于miR-211靶向Bax通過何種具體調控機制影響血管平滑肌細胞凋亡機制還不清楚，在以后實驗中會繼續探討。本次實驗結果為研究顱內動脈瘤分子發生機制提供了參考，為基因治療顱內動脈瘤提供了可能。