血清微小RNA-33、微小RNA-122水平與冠心病病人Gensini積分的相關性分析

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）是一種常見心血管疾病，好發于中老年人群，隨著現代生活方式的改變，該病發病率呈逐年上升趨勢，已成為人類致死率最高的疾病之一。微小RNA（microRNA，miRNA）是非編碼內源性小分子RNA，長度約為22～25個核苷酸，參與諸多腫瘤疾病的發生發展及細胞增殖凋亡等生物進程。據報道，miRNAs表達水平變化與心血管疾病的發生發展密切相關。近期研究發現，miRNA不僅僅是一種生物標志物，還可能是引起冠心病的又一危險分子。Gensini積分是目前公認的可全面反映冠心病血管病變嚴重程度的量化指標。目前，國內外關于miR-33、miR-122水平與冠心病病人Gensini積分的相關性分析研究較少。本研究通過觀察冠心病病人血清miR-33、miR-122水平及Gensini積分，并分析其相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機抽簽法選取2014年1月至2015年12月在南陽市第一人民醫院做冠脈造影術的冠心病病人200例為冠心病組，男性96例，女性104例，年齡45～75歲，平均年齡（54.69±7.61）歲；對照組120例，男性63例，女性57例，年齡46～77歲，平均年齡（54.32±7.85）歲。本研究中樣品的采集獲得病人、近親屬的知情同意，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 選取標準

納入標準：①冠脈造影術顯示至少一支冠脈血管狹窄≥50%者；②所有調查研究均自愿且經病人及其近親屬同意，并簽字確認；③年齡均≥40歲。排除標準：①患有惡性腫瘤、嚴重肝臟、腎臟等臟器功能不全、自身免疫性疾病者；②精神狀態異常、生活不能自理者；③伴有心肌梗死、心臟瓣膜病、慢性心肌炎、急性心肌炎、心包炎、先天性心臟病等病人；④患有肺動脈栓塞、結締組織病者。

1.3 方法

1.3.1

主要試劑及儀器 Trizol試劑（DP424）購于天根生化科技有限公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix（貨號Q111-02）購于南京vazyme公司；miR-33、miR-122及內參U6引物由上海生工生物公司合成。紫外分光光度計（型號ND-2000C）購于美國Thermo公司、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）儀（型號T100）購于美國Bio-Rad公司。

1.3.2

qRT-PCR檢測血清miR-33、miR-122水平采集受試者晨起空腹靜脈血約5 mL，常溫離心10 min（3 500 r/min），收集血清-80℃超低溫冰箱中保存備用。采用Trizol試劑提取受試者血清中的總RNA并通過紫外分光光度計測定其中RNA的濃度和純度。經過反轉錄得到互補DNA（cDNA），采用qRT-PCR檢測受試者血清中miR-33、miR-122的相對表達量。反應體系：10μL miScript SYBR?Green Mix，1μL cDNA（50 mg/L），0.5μL正向、反向引物（10μM），8.0μL雙蒸水（ddH2O）。反應條件（40個循環）：95℃（90 s）；95℃（30 s）；63℃（30 s）；72℃（15 s）。miR-33、miR-122、內參U6的引物序列見表1。采用2法分析受試者血清中miR-33、miR-122的相對表達水平。

1.3.3

Gensini積分計算標準 冠脈造影檢查及Gensini積分由該院資深心內科醫師完成，Gensini積分標準參考美國心臟協會規定的冠脈血管圖像分段評價標準Gensini積分系統：根據冠狀動脈狹窄程度進行評分：正常，0分；≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分。系數根據不同狹窄部位確定：左主干，系數為5；左前降支近段，系數為2.5，中段，系數為1.5，遠段，系數為1.0；第一對角支，系數為1.0，第二對角支，系數為0.5；回旋支近段，系數為2.5，中段，系數為1.5，遠段，系數為1.0；后降支，系數為1.0；后側支，系數為0.5；右冠近、中、遠后降支，系數為1.0。根據冠心病的病變支數分組：單支組（回旋支、前降支、右冠任1支發生病變，血管狹窄≥50%）；2支組（回旋支、前降支、右冠任2支有病變，左主干病變屬2支組，至少1支血管狹窄≥70%）；3支組（回旋支、前降支、右冠均發生病變，至少1支血管狹窄≥90%）。按照公式計算Gensini積分=（單處病變狹窄程度積分×相應系數）×總支數。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物序列

2 結果

2.1 對照組、冠心病組病人一般資料比較

與對照組相比，冠心病組病人年齡、性別、腰臀比、血清肌酐異常比例和冠心病家族史比例均差異無統計學意義（

P

＞0.05），吸煙比例、高血壓病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇（LDL）水平顯著較高（

P

＜0.05）。見表2。

表2 冠心病組和對照組病人一般臨床資料比較

2.2 對照組、冠心病組病人血清中miR

-

33、miR

-

122水平比較

與對照組相比，冠心病組病人血清中miR-33、miR-122水平顯著升高（

P

＜0.05）。見表3。

表3 冠心病組和對照組血清miR-33、miR-122水平比較/±s

2.3 冠心病組各亞組血清中miR

-

33、miR

-

122水平及Gensini積分比較

2支組、3支組miR-33、miR-122水平及Gensini積分均較單支組顯著升高（

P

＜0.001）；與2支組相比，3支組miR-33、miR-122水平及Gensini積分顯著升高（

P

＜0.001）。詳見表4。

表4 冠心病組中各亞組血清中miR-33、miR-122水平及Gensini積分比較/±s

2.4 冠心病各亞組病人血清中miR

-

33、miR

-

122水平與Gensini積分的相關性分析

Pearson分析結果顯示，miR-33水平和Gensini積分呈正相關（

r

=0.706，

P

＜0.001）；miR-122水平和Gensini積分呈正相關（

r

=0.458，

P

＜0.001）。

2.5 logistic回歸分析冠心病的危險因素

為了確定冠心病的危險因素，以冠心病年齡、性別、腰臀比、血清肌酐異常和冠心病家族史、吸煙、高血壓病史、糖尿病病史、三酰甘油、LDL含量、血清miR-33、miR-122水平為自變量進行多因素logistic回歸分析，結果顯示LDL含量、miR-33、miR-122水平及年齡是冠心病的獨立危險因素（

OR

=1.862，95%

CI

：1.359～2.57；

OR

=4.157，95%

CI

：2.597～6.654；

OR

=4.196，95%

CI

：2.362～7.453，

OR

=1.824，95%

CI

：1.213～2.454）。詳見圖1。

圖1 影響冠心病發生的危險因素分析森林圖

3 討論

冠心病是一種常見的心血管疾病，是以動脈粥樣硬化為病理基礎導致冠狀動脈狹窄的一種疾病，該病涉及血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖遷移及炎性介質釋放等慢性病變過程。據不完全統計，我國每年因疾病死亡病人中冠心病病人約占50%，且發病率呈逐年上升趨勢，目前已經成為危害我國居民健康的第2殺手。因此，加強冠心病預防、豐富早期診斷方法、提高治療成功率為現階段研究熱點。miRNA是一種內源性小RNA，在進化過程中高度保守，且可穩定存在于血清或血漿等多種液體中，主要通過轉錄后調控基因表達參與機體的各種生理、病理過程，并與冠心病的發生、發展過程密切相關。因此本實驗擬探究miR-33、miR-122水平與冠心病Gensini積分的相關性，以期為冠心病的早期診斷提供一定有價值的理論參考。

本研究發現，冠心病組病人在吸煙比例、高血壓病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及LDL水平顯著高于對照組，提示冠心病的發生可能與生活習慣有關，不良生活習慣可能增加冠心病發生風險。進一步研究結果顯示，冠心病組病人血清中miR-33、miR-122水平均顯著高于對照組，且隨著冠心病血管病變支數增多，miR-33、miR-122水平依次升高。miR-33存在于大多數組織中，其基因序列和位置均高度保守，主要包含兩個亞型，miR-33a和miR-33b。研究表明，miR-33可以影響固醇合成和脂肪β氧化以及脂質代謝過程，上調miR-33a表達，血漿膽固醇含量會增加，抑制miR-33表達，血漿中膽固醇含量降低，HDL含量顯著增加，動脈粥樣硬化程度會減弱。有研究發現，過表達miR-33可促進冠心病的發生發展，miR-33可能成為冠心病發生發展的一個生物標志物。miR-122是一種在成年人肝臟細胞中高度表達的miRNA，研究表明，腺病毒高表達miR-122會增加肝臟中合成膽固醇基因如Mmgrcs1、Dhcr7等表達，抑制miR-122表達后，會影響肝臟功能，使膽固醇合成效率降低。膽固醇的合成代謝與冠心病以及其他心血管疾病密切相關。綜合以上研究及本研究結果，提示冠心病病人血清miR-33、miR-122高表達與病人病情發展有關。

研究發現，miR-181b在冠心病病人血漿中低表達，與Gensini積分呈負相關，具有抗動脈粥樣硬化作用；miR-130a在冠心病病人血漿中高表達，與Gensini積分呈正相關關系，發揮促動脈粥樣硬化作用。miR-21可通過抵抗缺血引起的心肌死亡發揮心肌保護作用，在冠心病的發生發展過程中發揮重要作用。以上研究提示，多種miRNA表達可能參與冠心病發生發展。研究顯示，miR-33與Gensini積分呈正相關關系，可促進冠心病的發生發展進程。本研究結果顯示，miR-33、miR-122在冠心病病人血清中均高表達，且與病人Gensini積分呈正相關，提示血清miR-33、miR-122水平可能與冠心病病人嚴重程度有關。logistic回歸分析結果顯示，miR-33、miR-122水平升高、LDL含量增多以及年齡均為冠心病發生的獨立危險因素，提示miR-33、miR-122高表達與冠心病發生有關。

綜上所述，冠心病病人血清中miR-33、miR-122表達水平均顯著上調，且與Gensini積分正相關，是影響冠心病發生的危險因素，推測檢測血清miR-33、miR-122水平可能作為評估冠心病病人病情的指標，其具體機制有待進一步研究。