某三甲醫院呼吸科銅綠假單胞菌耐藥性及流行病學10年間變化

銅綠假單胞菌是醫院獲得性感染的重要機會病原菌之一，常引起囊性纖維化住院病人的慢性肺部感染。由于銅綠假單胞菌具有固有耐藥和獲得性耐藥的特性，治療該菌引起的感染可供選擇的抗生素種類非常有限。碳青霉烯類抗菌藥物由于具有較高的青霉素結合蛋白親和能力、超廣譜β-內酰胺酶穩定性及細菌外膜滲透性，對多重耐藥銅綠假單胞菌引起的嚴重感染具有良好的治療效果。然而，抗菌藥物的廣泛及不合理使用造成耐碳青霉烯銅綠假單胞菌在全球范圍內呈現不斷升高的趨勢，這給臨床治療帶來了巨大挑戰。

根據全國細菌耐藥檢測網數據顯示，近年來肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥率持續升高，而銅綠假單胞菌的耐藥性卻有明顯下降的趨勢。目前國內外雖已有大量文獻研究銅綠假單胞菌的耐藥性和耐藥機制，然而關于時間跨度較長的調查研究卻尚少有報道。銅綠假單胞菌作為呼吸道感染病人的最常見病原菌，分離率僅次于鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯氏菌，本研究擬對2007—2008年間和2017—2018年間成都醫學院第一附屬醫院呼吸科臨床分離的銅綠假單胞菌進行調查研究，比較分析10年間菌株的耐藥性和分子流行病學變化，為臨床合理選擇抗菌藥物及控制銅綠假單胞菌感染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

美洛培南（批號130506-202004）、頭孢哌酮（批號130420-201105）、哌拉西林（批號130419-202008）、頭孢他啶（批號130484-201806）、慶大霉素（批號130326-201716）、左氧氟沙星（批號130455-201607）、環丙沙星（批號130451-201904）、妥布霉素（批號130527-200402）、阿米卡星（批號130335-200204）和氨曲南（批號130507-201303）購自中國食品藥品檢定研究院、亞胺培南（批號MB1457-S）購自大連美侖生物技術有限公司、MH瓊脂（貨號CM901）購自北京陸橋技術有限公司、LB培養基（貨號L8291）購自北京索萊寶科技有限公司、細菌基因組DNA提取試劑盒（貨號DP302）和DNA marker（貨號MD114）購自北京天根生化科技有限公司、2×Es Taq MasterMix（貨號CW0690S）購自北京康為世紀生物科技有限公司、引物合成和測序由上海生工生物公司完成；MIP-P型細菌多點接種儀（日本佐久間公司）、CFX96型PCR擴增儀、PowerPac型電泳儀和Gel DocXR+型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 菌株分離及鑒定

收集2007—2008年間和2017—2018年間成都醫學院第一附屬醫院呼吸科住院病人臨床送檢標本分離出的銅綠假單胞菌。醫院感染的判斷標準根據美國疾病控制與預防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）關于醫療保健相關感染的定義和特定類型感染的標準進行。納入標準為病人住院時間＞48 h，同一個病人僅僅收集1株銅綠假單胞菌；排除標準為沒有任何感染癥狀的銅綠假單胞菌感染病人。分離培養出的菌株采用生化分析、Vitek系統和16S rRNA測序進行鑒定。

1.3 最低抑菌濃度測定

采用瓊脂平板倍比稀釋法測定銅綠假單胞菌對抗生素的敏感程度。細菌接種在LB平板上，然后倒置于37℃恒溫箱中培養18 h。抗生素使用滅菌的生理鹽水倍比稀釋后加入到空培養皿中，然后將MH瓊脂加入到培養皿緩慢搖勻，使其抗生素的終濃度達到0.5～256.0μg/mL。銅綠假單胞菌在滅菌的鹽水管中稀釋到0.5個麥氏單位，然后用接種儀點種在含不同濃度抗生素的MH瓊脂平板上，在37℃恒溫箱中培養18～20 h后讀取結果。

1.4 多位點序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）

采用MLST技術對菌株進行基因分型。參照文獻設計和合成銅綠假單胞菌的7個管家基因的引物序列。使用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒對銅綠假單胞菌的DNA進行提取純化。50μL PCR反應體系成分為：25μL 2×Es Taq Mastermix，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL DNA模板，22μL ddHO。PCR反應條件：最初96℃預變性1 min；然后96℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，重復此循環30次；最后再72℃延伸10 min。擴增完成后，PCR產物經凝膠電泳驗證和膠回收純化后送測序公司進行序列測定。管家基因的DNA序列在銅綠假單胞菌的MLST數據庫（https：//pubmlst.org/paeruginosa/）上進行比對從而獲得等位基因和序列型（Sequence Type，ST）。然后通過eBURST軟件將得到的所有ST基因型進行聚類分析，其中具有5個或5個以上相同等位基因的ST即為同一個克隆復合體（Clonal Complex，CC）。

1.5 碳青霉烯酶耐藥基因分析

采用PCR擴增耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌是否攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，其引物序列如表1所示。擴增反應條件為：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，52～56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復此循環30次；最后再72℃延伸10 min。PCR擴增完成后，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行證實，將電泳結果為陽性的PCR產物送測序公司進行序列測定。測序序列在NCBI數據庫進行BLAST比對，獲得耐藥基因類型。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對統計學資料進行分析。2007—2008年和2017—2018年銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性差異采用

χ

檢驗，其中以

P

＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株分離鑒定和藥敏結果

2007—2008年間共從3 028例住院病人臨床標本中分離出134株銅綠假單胞菌，檢出率為4.4%；2017—2018年間共從4 276例住院病人臨床標本中分離出85株銅綠假單胞菌，檢出率為2.0%。

表1 銅綠假單胞菌碳青霉烯酶耐藥基因擴增引物序列

10年間銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥性變化如表2所示。2007—2008年間銅綠假單胞菌對幾乎所有抗菌藥物的耐藥率均＞55%（阿米卡星除外）。2017—2018年間銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率則均＜30%。此外，2007—2008年間菌株的耐藥性高于2017—2018年間菌株的耐藥性（

P

＜0.001）。

2.2 MLST分型

10年間銅綠假單胞菌的MLST基因型差異如表3所示。2007—2008年間，134株銅綠假單胞菌共分為15個ST型，其中ST235和ST111是最流行的基因型，分別占33.6%（45）和20.1%（27）。此外，ST244、ST298、ST175、ST357和ST316基因型分布也較為普遍，分別占11.2%（15）、7.5%（10）、6.0%（8）、5.2%（7）和3.7%（5）。2017—2018年間，85株銅綠假單胞菌共分為9個ST型，其中以ST235、ST175、ST244、ST111和ST308基因型為主，分別占38.8%（33）、22.4%（19）、11.8%（10）、9.4%（8）和7.1%（6）。

表2 10年間銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥性變化/%（株）

利用eBURST軟件將所有獲得的ST型與數據庫中已知存在的ST比較分析顯示，本研究中ST235、ST1162、ST227和ST85型共86株菌屬于CC235，其中ST235是該復合體的根，ST1162、ST227和ST85均由ST235型進化而來（圖1A）。ST244、ST17和ST111型共62株菌屬于CC274，其中ST274是該復合體的根，ST244、ST17和ST111型均由ST274型進化而來（圖1B）。

2.3 碳青霉烯酶基因分析

2007—2008年間共有78株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌，通過PCR擴增碳青霉烯酶耐藥基因并測序，有14株攜帶金屬β-內酰胺酶基因IMP-4，5株攜帶金屬β-內酰胺酶基因VIM-2。然而，2017—2018年間共有12株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌，其中僅有2株攜帶IMP-4基因，其它耐藥基因均擴增陰性（圖2，3）。

3 討論

圖2 耐碳青霉烯銅綠假單胞菌78株PCR擴增后金屬β-內酰胺酶基因IMP陽性產物電泳圖

表3 2007—2008年間和2017—2018年間銅綠假單胞菌多位點序列分型結果比較/%（株）

圖3 耐碳青霉烯銅綠假單胞菌78株PCR擴增后金屬β-內酰胺酶基因VIM陽性產物電泳圖

臨床上50%～70%的呼吸道感染均由銅綠假單胞菌引起。呼吸道銅綠假單胞菌感染是病人慢性阻塞性肺疾病和呼吸衰竭的主要原因，可引起較高的發病率和死亡率。在本研究中，近兩年銅綠假單胞菌的檢出率明顯下降，這可能與該院嚴格執行抗生素管理和感染控制措施得當有很大關系。此外，與全國細菌耐藥檢測網數據一致，該院呼吸科銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率同樣具有明顯下降的趨勢，可能與以下原因有關：（1）該院自2011年開始應衛生部要求開展抗菌藥物臨床應用專項整治活動，規范了抗生素的使用，使得抗生素使用率和使用強度均有所降低，抗生素產生的選擇性壓力降低；（2）外源耐藥基因的獲得也是細菌產生耐藥的一個重要因素，很多耐藥基因都位于質粒上，可以在菌株之間快速傳播，然而銅綠假單胞菌獲得耐藥基因的能力比鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯氏菌弱。除此之外，還有很多因素影響細菌的耐藥性，如產生抗生素滅活酶或鈍化酶、藥物作用靶位改變、外膜通透性下降及形成生物膜等，其耐藥性下降的具體原因還有待進一步研究。近兩年該院呼吸科銅綠假單胞菌對碳青霉烯類和氨基糖苷類藥物敏感性最高。氨基糖苷類藥物因其毒副作用比較大，臨床應用較少，因此碳青霉烯類藥物仍是臨床治療該菌感染的首選藥物。

MLST是通過對管家基因進行擴增、測序和比對，分析菌株的基因型差異，因具有操作簡便、分辨率高、重復性好等特點，目前是一種比較常用的細菌基因分型方法。本研究MLST結果顯示該院呼吸科最流行的基因型為ST235、ST111、ST175和ST244，聚類分析顯示大部分菌株屬于CC235和CC274，這與國內外流行的基因型具有相似性，但也存在地域特點，提示我們在進行感染控制及抗菌藥物治療中應該更多地參考本地域內的流行特點。雖然研究中兩個時間段流行的基因型比例有所變化，但流行的基因類型變化不大，提示該院呼吸科具有穩定的MLST基因型譜，菌株具有長期穩定遺傳的特點。

碳青霉烯酶特別是金屬β-內酰胺酶（metallo-βlactamase，MBL）的產生是銅綠假單胞菌的一個重要耐藥機制。MBLs能夠水解碳青霉烯類和其他β-內酰胺類抗生素，但不能被酶抑制劑如克拉維酸或他唑巴坦所抑制。IMP和VIM型金屬酶是目前銅綠假單胞菌最普遍、分布比較多的基因類型，也是出現最早的兩種酶，隨后其他金屬β-內酰胺酶如SPM-，GIM-，SIM-，KHM-，NDM-，AIM-，DIM-等相繼出現。在本研究中，2007—2008年間分別有14株和5株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌攜帶IMP-4和VIM-2基因，陽性率為17.9%和6.4%。而2017—2018年間只有2株菌（16.7%）攜帶IMP-4基因，未發現其他耐藥基因。近兩年菌株攜帶耐藥基因較少可能與其對碳青霉烯類抗生素的耐藥率降低有關。本研究碳青霉烯耐藥基因陽性率低于其他國內外研究報道，說明在該院呼吸科銅綠假單胞菌的耐藥作用機制中，OprD2缺失或外排泵高表達或AmpC高表達導致的碳青霉烯類耐藥具有較高的比例，可能在銅綠假單胞菌耐碳青霉類抗菌藥物中起到重要作用，然而具體的耐藥機制有待于進一步研究。