HPLC 法測定曲安奈德益康唑乳膏中的有關(guān)物質(zhì)

郭盛合

華潤三九（南昌）藥業(yè)有限公司，江西 南昌 330012

曲安奈德益康唑乳膏，每克分別含曲安奈德1.0 mg 和硝酸益康唑10 mg，曲安奈德為腎上腺皮質(zhì)激素類藥，具有抗炎抗過敏作用，硝酸益康唑?yàn)檫溥蝾惪拐婢帲瑑烧呗?lián)合用于治療伴有真菌感染或有真菌感染傾向的皮炎、濕疹；由皮膚癬菌、酵母菌、霉菌所致的炎癥性皮膚真菌??；由真菌、細(xì)菌所致的皮膚混合感染等。目前國外藥典均未收載曲安奈德益康唑乳膏，《中國藥典》二部（2015 年版）［1］已收載但無有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。因此，筆者參考各國藥典原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)［2-12］，建立了高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫測定曲安奈德益康唑乳膏中有關(guān)物質(zhì)的方法，以便更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀、梅特勒XS205電子分析天平、S220B 酸度計(jì)。

1.2 藥品與試劑

曲安奈德益康唑乳膏［華潤三九（南昌）藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20074155，規(guī)格：1 g ∶曲安奈德1 mg ∶硝酸益康唑10 mg，批號(hào)：161201、161202、161203］；曲安奈德雜質(zhì)A（即曲安西龍，編號(hào)E-Y0001459）、曲安奈德（編號(hào)100055）、硝酸益康唑（編號(hào)100214）、苯甲醇（編號(hào)100419）均為中檢院對(duì)照品，曲安奈德雜質(zhì)B（編號(hào)T-T-5318）、曲安奈德雜質(zhì)C（編號(hào)L-MM0198.05）、硝酸益康唑雜質(zhì)A（編號(hào)T-I-292）、硝酸益康唑雜質(zhì)B（編號(hào)T-E-543）、硝酸益康唑雜質(zhì)C（編號(hào)T-E-544）均為TLC 標(biāo)準(zhǔn)品。

甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil 100-5 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為45 ℃；以0.077%醋酸銨緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0）-甲醇（80∶20）為流動(dòng)相A；甲醇-乙腈（40∶60）為流動(dòng)相B；流速為1.0 mL/min；按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為240 nm 和225 nm。

表1 HPLC梯度洗脫程序

2.2 系統(tǒng)適用性

另取本品于105 ℃干燥箱中放置2 h，取出后照供試品溶液制備法操作，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在240 nm 下曲安奈德峰保留時(shí)間約為15～17 min，在相對(duì)曲安奈德峰tR 約0.45 處應(yīng)有雜質(zhì)峰，該雜質(zhì)峰與苯甲酸峰（相對(duì)曲安奈德峰tR約0.5）之間的分離度應(yīng)不低于1.5。

2.3 溶液的制備

取本品，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，60 ℃水浴加熱并振搖使其溶解，冰浴30 min，趁冷濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.4 測定法

精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果判定：240 nm 下，供試品溶液色譜圖中在相對(duì)曲安奈德峰保留時(shí)間約0.45 和0.88～1.16 間如有雜質(zhì)峰，除曲安奈德峰外，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積的0.5 倍（0.5%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液曲安奈德峰面積的2.0 倍（2.0%）；225 nm 下，供試品溶液色譜圖中相對(duì)曲安奈德峰保留時(shí)間0.25～2.5 之間如有雜質(zhì)峰，除溶劑梯度峰、苯甲酸峰（相對(duì)曲安奈德峰保留時(shí)間約0.5）、曲安奈德峰（15～17 min）、益康唑峰、二丁基羥基甲苯峰（相對(duì)曲安奈德峰保留時(shí)間約2.4）外，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液益康唑峰面積的0.2 倍（0.2%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液益康唑峰面積的1.0 倍（1.0%）。

2.5 輔料干擾及雜質(zhì)定位分離試驗(yàn)

取主藥雙陰性樣品、曲安奈德單方制劑樣品、硝酸益康唑單方制劑樣品、自制樣品照2.3 供試品溶液的制備方法制成供試品溶液；另取曲安奈德及其已知雜質(zhì)對(duì)照品、硝酸益康唑及其已知雜質(zhì)對(duì)照品加甲醇溶解并稀釋制成混合對(duì)照品溶液；另取自制樣品供試品溶液加入混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液，制成加雜質(zhì)的供試品溶液。精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算各峰分離度。

2.5.1 輔料干擾與雜質(zhì)分離 供試品溶液和加雜質(zhì)的供試品溶液有關(guān)物質(zhì)色譜圖見圖1。

圖1 供試品和加雜質(zhì)供試品的有關(guān)物質(zhì)色譜圖

加雜質(zhì)的供試品溶液在240 nm 下，陰性樣品、硝酸益康唑及其雜質(zhì)在曲安奈德主峰、曲安奈德雜質(zhì)峰、硝酸益康唑單方制劑出峰位置處無色譜峰干擾，表明陰性樣品、硝酸益康唑及其雜質(zhì)色譜峰對(duì)曲安奈德及其雜質(zhì)檢測無干擾；曲安奈德及其雜質(zhì)與相鄰色譜峰分離度符合要求，表明240 nm 下曲安奈德及其雜質(zhì)分離度良好，見表1。

加雜質(zhì)的供試品溶液在225 nm 下，陰性樣品、曲安奈德及其雜質(zhì)（RRT 在0.45～0.70，0.90～1.18）在硝酸益康唑主峰、硝酸益康唑雜質(zhì)對(duì)照品、硝酸益康唑單方制劑出峰位置處無色譜峰，表明對(duì)硝酸益康唑及其雜質(zhì)檢測無干擾；硝酸益康唑及其雜質(zhì)與相鄰色譜峰分離度大部分均符合要求。其中，僅在RRT 1.32 處雜質(zhì)峰和益康唑峰的分離度為0.34，主要是硝酸益康唑濃度過載導(dǎo)致，但該雜質(zhì)為非降解雜質(zhì)，雜質(zhì)量僅為0.01%，可以忽略不計(jì)。上述結(jié)果表明225 nm 下硝酸益康唑及其雜質(zhì)分離度良好，見表2。

表1 加雜質(zhì)的樣品曲安奈德有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果（240 nm）

表2 加雜質(zhì)的樣品益康唑有關(guān)物質(zhì)結(jié)果（225 nm）

2.5.2 雜質(zhì)定位 對(duì)照品溶液雜質(zhì)定位結(jié)果見表3。

表3 雜質(zhì)定位結(jié)果

該方法下曲安奈德和硝酸益康唑的雜質(zhì)能被有效分離和檢出，方法專屬性良好。

2.6 檢測限

分別取曲安奈德對(duì)照品溶液、硝酸益康唑?qū)φ掌啡芤骸⒏鲉蝹€(gè)已知雜質(zhì)對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，照擬定的有關(guān)物質(zhì)檢查法測定，直至對(duì)應(yīng)的色譜峰信噪比符合規(guī)定，見表4。

曲安奈德1%對(duì)照溶液的進(jìn)樣量為0.1 μg，報(bào)告限度0.05%的進(jìn)樣量為5 ng；硝酸益康唑1%對(duì)照溶液的進(jìn)樣量為1 μg，報(bào)告限度0.05%的進(jìn)樣量為50 ng。由上表可知，硝酸益康唑各雜質(zhì)檢測限均低于報(bào)告限度，曲安奈德除雜質(zhì)C 檢測限濃度約相當(dāng)于0.06%外，也均低于報(bào)告限度，表明本方法能有效檢出已知雜質(zhì)。

表4 檢測限結(jié)果表

2.7 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

采用主成分自身對(duì)照法測定樣品中的有關(guān)物質(zhì)。取3 批樣品（30 ℃±2 ℃，65%±5% RH 加速試驗(yàn)6 個(gè)月），按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照溶液。取上述供試品溶液、對(duì)照溶液和“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，3 批樣品有關(guān)物質(zhì)均符合規(guī)定，見表5。

表5 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液濃度的確定

本品為復(fù)方制劑，曲安奈德和硝酸益康唑規(guī)格分別為0.1%和1%。查閱國內(nèi)外藥典同品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)獲悉，《中國藥典》（2015 年版）曲安奈德原料藥、注射劑、USP36 曲安奈德原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下供試品濃度均為0.5 mg/mL，進(jìn)樣體積20 μL；《中國藥典》（2015 年版）、EP 8.0、BP 2013 硝酸益康唑原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下供試品濃度為10 mg/mL，進(jìn)樣體積10 μL。為確保供試品溶液進(jìn)樣質(zhì)量與上述標(biāo)準(zhǔn)接近，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)考察，本品取樣10 g，用甲醇20 mL 溶解，進(jìn)樣體積為20 μL 時(shí)，曲安奈德和硝酸益康唑進(jìn)樣質(zhì)量與國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)（忽略基質(zhì)體積下），且樣品前處理簡便。繼續(xù)提高濃度，樣品則無法除基質(zhì)，無法操作。

3.2 供試品溶液處理方法的確定

本品首先采用加熱法提取主藥和雜質(zhì)，取樣品10 g，加甲醇20 mL，在60 ℃水浴下振搖，可使膏體溶解分散均勻。冰浴30 min 后，大量基質(zhì)析出，此時(shí)趁冷用濾紙濾過可有效去除基質(zhì)，減小對(duì)色譜柱的損害。由于該步驟基質(zhì)較多，直接用0.45 μm過濾器難以濾過，故先用濾紙過濾。

3.3 系統(tǒng)適用性

本品曲安奈德主要降解雜質(zhì)之一為曲安西龍，為曲安奈德高溫降解產(chǎn)物（制劑在105 ℃加熱2 h后生成約1%），其保留時(shí)間與本品中的防腐劑苯甲酸接近，兩者最難分離（分離度約為1.5～2.0），故在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中規(guī)定曲安西龍與苯甲酸色譜峰之間的分離度不低于1.5。本品中曲安奈德和硝酸益康唑濃度相差10 倍，紫外吸收光譜差別較大，曲安奈德及其主要雜質(zhì)最大吸收為240 nm，硝酸益康唑及其雜質(zhì)最大吸收為200 nm 左右，在225 nm 左右有肩峰。國內(nèi)外藥典同品種有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下，《中國藥典》（2015 年版）曲安奈德原料藥、注射劑采用240 nm 作為雜質(zhì)檢查波長，EP8.0 原料藥則采用254 nm 為雜質(zhì)檢查波長。《中國藥典》（2015 年版）、EP8.0 和BP2013 硝酸益康唑原料藥均采用225 nm作為雜質(zhì)檢查波長，制劑多未收載有關(guān)物質(zhì)檢查或僅用TLC 法。因此，本品在方法開發(fā)過程中采用225、240、254 nm 三波長和190～400 nm 全波長掃描進(jìn)行雜質(zhì)研究。結(jié)果表明，曲安奈德在240 nm 下檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)最多，硝酸益康唑在225 nm 下檢出雜質(zhì)最多。故分別設(shè)定檢測波長225 nm（硝酸益康唑雜質(zhì)）和240 nm（曲安奈德雜質(zhì)）。

3.4 雜質(zhì)歸屬

本品有關(guān)物質(zhì)檢查方法開發(fā)過程按照復(fù)方制劑有關(guān)物質(zhì)研究思路開展，采用原料藥、單方、復(fù)方進(jìn)行雜質(zhì)譜研究，對(duì)產(chǎn)品在貯藏過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行了歸屬。對(duì)耐用性的考察結(jié)果顯示，在確定的色譜條件下，各雜質(zhì)分離良好，相對(duì)保留時(shí)間較為穩(wěn)定。故采用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行雜質(zhì)定位。本品色譜檢查中，溶劑、輔料、主藥、雜質(zhì)的出峰順序和相對(duì)保留時(shí)間詳見表6。

表6 色譜峰的出峰順序和相對(duì)保留時(shí)間

3.5 限度

曲安奈德制劑僅有BP2013 鼻噴霧劑和《中國藥典》（2015 年版）注射劑收載了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，BP2013 鼻噴霧劑規(guī)定任一色譜峰不得大于1%，《中國藥典》（2015 年版）注射劑規(guī)定單雜不得過0.5%，總雜不得過1.5%。本品主要參考《中國藥典》注射劑的要求，擬定曲安奈德單雜不得過0.5%，由于本品在40 ℃加速2 月時(shí)曲安奈德總雜已經(jīng)接近1.0%，故擬定總雜不得過2.0%。

硝酸益康唑制劑國內(nèi)外藥典多未收載有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，因此主要參考原料藥有關(guān)物質(zhì)限度規(guī)定［EP8.0 已知雜質(zhì)不得大于0.2%，未知雜質(zhì)不得過0.1%；《中國藥典》（2015 年版）單雜不得大于0.2%］，結(jié)合本品40 ℃加速2 月有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果（單雜0.08%，總雜0.25%），擬定為：單雜不得大于0.2%，總雜不得大于1.0%。

綜上所述，本方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于曲安奈德益康唑乳膏中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。