不同顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ亞基組合對(duì)小麥淀粉含量及面條品質(zhì)的影響分析

鄧志英，李文淑，郭迎新，趙云哲，陳廣鳳，王德華，王冠穎，田紀(jì)春?

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，小麥品質(zhì)育種研究室，山東 泰安 271018；2.德州學(xué)院 生態(tài)與資源環(huán)境學(xué)院，山東 德州 253000）

小麥?zhǔn)鞘澜缟蠌V泛種植的禾本科植物，約為世界上40%的人口提供能量和營(yíng)養(yǎng)。我國(guó)是小麥的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。小麥播種面積為24 507.99千公頃，約占全國(guó)的20.77%，產(chǎn)量為13 433.39萬噸，約占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的20.30%。小麥?zhǔn)俏覈?guó)第二大糧食作物，而且大部分人口都以小麥制品作為主食，其生產(chǎn)水平對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要意義。隨著我國(guó)人民飲食生活習(xí)慣和水平的不斷提高，人們對(duì)小麥產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味品質(zhì)的要求也在不斷提高。在保證產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，培育優(yōu)質(zhì)、廣適的小麥新品種，是我國(guó)小麥品質(zhì)育種的主要趨勢(shì)之一[1]。

淀粉是組成小麥干物質(zhì)的主要成分，約占小麥籽粒總重的75%，分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉中直鏈淀粉含量是影響面條品質(zhì)的重要因素，與面條的軟度、粘性、光滑性、口感和綜合評(píng)分等品質(zhì)參數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[2]。小麥直鏈淀粉含量和支鏈淀粉支鏈長(zhǎng)度分布對(duì)淀粉的糊化性有較大影響，對(duì)面包制作具有不可缺少的作用[3]。淀粉分支酶(SBE)[4]、可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉去分支酶(DBE)負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成[5]；而顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)是與直鏈淀粉合成直接有關(guān)的酶[6-7]，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶有兩個(gè)同工酶，根據(jù)其發(fā)揮作用的場(chǎng)所劃分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅱ，其中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ(GBSSⅠ)也稱為 Wx蛋白。而關(guān)于根莖葉和其它非貯藏器官的直鏈淀粉合成是顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅱ[8]。Wx蛋白由3種亞基組成，分別是Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1。Wx-A1位于7A染色體上短臂上，Wx-B1位于4A染色體長(zhǎng)臂上、Wx-D1位于7D染色體短臂上。Wx蛋白與直鏈淀粉的合成密切相關(guān)，其隱性突變體籽粒中直鏈淀粉含量下降[9]。研究表明：小麥直鏈淀粉含量與 Wx蛋白相對(duì)含量呈高度正相關(guān)。缺失Wx蛋白會(huì)引起直鏈淀粉含量的減少。Miura[10]的研究發(fā)現(xiàn)，Wx-B1蛋白對(duì)直鏈淀粉含量影響最大。降低直鏈淀粉含量，改善淀粉特性，可以使面粉擁有更好的面條品質(zhì)參數(shù)。但是，前人對(duì)不同Wx蛋白亞基缺失對(duì)干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)及煮熟面條品質(zhì)的拉伸參數(shù)研究較少。因此，本研究以含有不同 Wx蛋白亞基缺失類型的重組自交系(RIL)群體為材料，檢測(cè)其Wx蛋白重組類型，并對(duì)不同重組類型的直、支鏈淀粉的含量進(jìn)行分析；同時(shí)對(duì)干、濕面條品質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)構(gòu)參數(shù)的分析；其研究結(jié)果對(duì)面條品質(zhì)的改良具有較好的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小麥RIL群體是以藁城8901（父本）與糯麥1號(hào)（母本）雜交，通過單粒傳法獲得的純合家系的RIL群體。糯麥1號(hào)是以“江蘇白火麥”和“關(guān)東 107”雜交育成的全糯小麥品種；藁城 8901是以“77546-2”和“臨漳”育成的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種。兩親本在淀粉品質(zhì)和蛋白質(zhì)品質(zhì)方面存在顯著差異。2017—2018年種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地，3行區(qū)，2次重復(fù)。收獲的籽粒利用 Buhler磨進(jìn)行磨粉，出粉率在70%左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Wx蛋白亞基的鑒定

Wx蛋白提取方法及電泳步驟參考潘志芬[11]方法；電泳結(jié)果采用銀染[12]。

1.2.2 雙波長(zhǎng)法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量

配制淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取馬鈴薯直鏈淀粉純品（Sigma公司）和馬鈴薯支鏈淀粉純品（Sigma公司）0.100 0 g至100 mL燒杯中，加入0.5 mol/L KOH 10 mL，75 ℃水浴10 min，轉(zhuǎn)移至 100 mL容量瓶中，定容至 100 mL，即為1 mg/mL直、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用等吸收點(diǎn)作圖法選擇直、支鏈淀粉的測(cè)定的波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)，得出支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)為553 nm、參比波長(zhǎng)為740 nm，直鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)為790 nm，參比波長(zhǎng)為820 nm。

制作雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，用 UV-Vis Analyst軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù) r =0.996 2，支鏈淀粉含量 C(mg/mL) = -0.002 7+0.367 9*ΔA。制作雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，用UV-Vis Analyst軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)r = 0.999 6，直鏈淀粉含量C(mg/mL) = 0.000 0+0.220 5*ΔA。

1.2.3 面條制作

面粉用量為 100 g（14%濕基），加水量為吸水率的50%。采用美國(guó)KitchenAid和面儀一檔邊加水邊攪拌30 s，加水后一檔攪拌30 s，然后4檔攪拌2 min，最后2檔攪拌2 min。室溫（25 ℃）熟化 30 min，采用 JMTZ-14型面條機(jī)壓輥間距2 mm處軋面，再三折合片兩次、兩折合片各一次，然后將面片逐漸壓薄至1.0 mm（壓距分別為3.5、3.0、2.5、2、1.5、1 mm 各一次）。面片切成 2.0 mm寬的細(xì)長(zhǎng)面條，將切出的面條一部分掛在圓木棍上，放入恒溫（約40 ℃）恒濕（75%）箱內(nèi)，干燥10 h，然后再室溫干燥10 h，另一部分置于塑料封袋口中備用。

1.2.4 干面條斷裂參數(shù)測(cè)定

利用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，承重平臺(tái)HDP/90，附件A/SFR：包括上下兩個(gè)支撐槽。將干面條放置在探頭的上下兩個(gè)支槽之間，支撐槽以0.5 mm/s的速度緩慢向下移動(dòng)擠壓樣品，當(dāng)達(dá)到力量感應(yīng)元應(yīng)受到的最小的力(15 g)后，開始記錄數(shù)據(jù)，然后支撐槽以2.5 mm/s的速度繼續(xù)下移，面條逐漸被壓制彎曲直至斷裂，面條斷裂后，探頭以10.0 mm/s的速度返回起始位置。

1.2.5 濕面條拉伸參數(shù)測(cè)定

將待測(cè)面條用蒸餾水煮至白芯剛好消失；取出煮熟至白芯剛好消失的面條置于涼水中沖洗；然后利用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，承重平臺(tái)HDP/90，附件A/SPR：上下兩個(gè)相互平行的摩擦輪。測(cè)試臂以1.0 mm/s的速度緩慢上升，力量感應(yīng)元在感受到5 g的力后，測(cè)試臂以3.0 mm/s的速度移動(dòng)，同時(shí)傳感器開始記錄數(shù)據(jù)，當(dāng)面條受到的拉力超過它能承受的極限時(shí)，面條斷裂。探頭以10.0 s的速度自動(dòng)返回起始位置。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用DPS v7.05及SPSS11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx蛋白亞基組合類型分析

由圖1和表1可知，群體中共鑒定出8種Wx蛋白亞基組成類型，且8種類型分布比較均勻。其中野生型即 Wx蛋白亞基正常所占比例最多為13.94%。Wx蛋白亞基全缺失突變型即全糯比例最少，共 23個(gè)，占 11.06%。三種單缺失類型共77個(gè)，分別占 11.54%、12.02%、13.46%。三種雙缺失性與單缺失型比例相近，共79個(gè)，比例分別是13.46%、12.50%、12.02%。由此可知，群體中涵蓋了所有不同Wx蛋白亞基缺失組合類型。

表1 Wx蛋白亞基組合類型及比例Table 1 Combination types and proportions of Wx protein subunits

圖1 群體中不同Wx蛋白亞基缺失組合SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of different waxy protein subunits deletion combinations in RIL population

2.2 不同Wx蛋白亞基組合類型對(duì)小麥淀粉含量的影響

由表2可知，不同Wx蛋白亞基位點(diǎn)缺失對(duì)小麥直、支鏈淀粉含量都有一定的影響，但影響程度不同。就直鏈淀粉含量而言，Wx蛋白全缺失類型和野生型、單缺失和雙缺失類型相比，達(dá)5%顯著差異；單缺失類型中，Wx-A1蛋白缺失類型和其他兩個(gè)單缺失類型相比，達(dá)5%顯著差異；雙缺失類型之間直鏈淀粉含量有差異，但沒達(dá)顯著性差異。就支鏈淀粉含量而言，突變型與其他組合類型相比，達(dá)5%顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1蛋白缺失類型與其他兩種組合相比達(dá)5%顯著性差異；雙缺失類型之間有差異，但未達(dá)顯著水平。

表2 不同Wx蛋白亞基組合類型對(duì)直、支鏈淀粉含量的差異分析Table 2 Effect of different Wx protein subunits combination on amylose and amylopectin content %

2.3 不同Wx蛋白亞基組合類型對(duì)干面條質(zhì)構(gòu)參數(shù)的影響

由表 3可知，干面條斷裂強(qiáng)度以突變型即全糯型材料最好，不易斷裂，與野生型即正常型、Wx-D1缺失和Wx-A1和Wx-D1共同缺失類型呈1%極顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1缺失和Wx-B1缺失類型之間無顯著性差異；雙缺失類型之間，同時(shí)缺失Wx-B1和Wx-D1類型與同時(shí)缺失 Wx-A1和 Wx-D1類型之間達(dá) 5%顯著性差異，與同時(shí)缺失Wx-A1和Wx-B1類型之間無顯著性差異，由此可知，在雙缺失類型條件下，存在 Wx-B1缺失位點(diǎn)對(duì)面條干面條斷裂強(qiáng)度影響較大，不易斷裂。就干面條彈性而言，除Wx-D1缺失類型和突變型之間達(dá)5%顯著性差異外，其余組合類型之間差異都未達(dá)顯著。因此，對(duì)干面條質(zhì)構(gòu)參數(shù)而言，Wx蛋白亞基的缺失主要影響干面條斷裂強(qiáng)度。

表3 不同Wx蛋白亞基組合類型對(duì)干面條斷裂強(qiáng)度和彈性的差異分析Table 3 Effect of different Wx protein subunit combinations on the dry noodle quality

2.4 不同Wx蛋白亞基組合類型對(duì)面條拉伸參數(shù)的影響

由表4可知，就煮熟面條拉伸力而言，Wx-A1缺失類型與Wx-D1缺失類型、Wx-A1和Wx-B1同時(shí)缺失類型、Wx-A1和 Wx-D1同時(shí)缺失類型及突變類型達(dá)5%顯著性差異，與其他類型未達(dá)顯著性差異。單缺失類型之間，Wx-A1缺失類型和Wx-B1缺失類型間無顯著性差異，都與 Wx-D1缺失類型達(dá)5%顯著性差異；雙缺失類型之間無顯著性差異。

表4 不同Wx蛋白亞基組合的面條拉伸參數(shù)的比較分析Table 4 Effect of different Wx protein subunit combinations on the tensile parameters of cooked noodle

就拉伸距離而言，突變型即全糯型最好，與野生型、Wx-D1缺失類型都達(dá) 5%顯著性差異，與其他組合類型未達(dá)顯著性差異；單缺失類型之間，Wx-A1缺失類型和 Wx-B1缺失類型間無顯著性差異，都與Wx-D1缺失類型達(dá)5%顯著性差異，與拉伸力在單缺失類型之間的差異一致；雙缺失類型之間無顯著性差異，與拉伸力在雙缺失類型之間的差異一致。

就曲線面積而言，不同組合類型之間的差異與拉伸力之間的差異基本一致。即Wx-A1缺失類型與Wx-D1缺失類型、Wx-A1和Wx-B1同時(shí)缺失類型、Wx-A1和 Wx-D1同時(shí)缺失類型及突變類型達(dá)5%顯著性差異，與其他類型未達(dá)顯著性差異。雙缺失類型之間無顯著性差異，單缺失類型之間，除Wx-D1缺失類型外，也都無顯著性差異。

以上分析可知，單缺失類型條件下，影響煮熟面條拉伸參數(shù)嚴(yán)重程度為 Wx-A1缺失類型≥Wx-B1缺失類型＞W(wǎng)x-D1缺失類型；雙缺失條件下，以Wx-B1和Wx-D1同時(shí)缺失時(shí)為最優(yōu)；當(dāng)三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)缺失時(shí)，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，Wx蛋白可以控制直鏈淀粉的合成，進(jìn)而影響淀粉品質(zhì)和最終加工品質(zhì)。Wx蛋白基因的表達(dá)會(huì)影響直、支鏈淀粉含量及淀粉的糊化特性和膨脹特性。本研究發(fā)現(xiàn)，直支鏈淀粉含量的差異與Wx蛋白亞基的組合類型密切相關(guān)。Wx蛋白全缺失類型直鏈淀粉含量和野生型、單缺失和雙缺失類型相比都達(dá)到了顯著差異；單缺失類型中，Wx-A1蛋白缺失類型的直鏈淀粉含量和其他兩個(gè)單缺失類型相比達(dá)顯著差異；雙缺失類型之間直鏈淀粉含量有差異，但沒達(dá)顯著性差異。總體而言，直鏈淀粉含量的高低以野生型＞單缺失類型＞雙缺失類型＞突變型（全缺失類型），與前人的研究基本一致[15-16]。前人研究發(fā)現(xiàn) Wx-B1位點(diǎn)的缺失對(duì)面條品質(zhì)尤其是面條的滑爽性影響較大[17-18]，而對(duì)干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)及煮熟面條品質(zhì)拉伸參數(shù)的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在雙缺失類型條件下，當(dāng)組合中存在Wx-B1缺失位點(diǎn)時(shí)對(duì)面條干面條斷裂強(qiáng)度影響較大，不易斷裂；而干面條彈性方面，除Wx-D1缺失類型和突變型之間達(dá)顯著性差異外，其余組合類型之間差異都未達(dá)顯著。因此，對(duì)干面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)而言，Wx蛋白亞基的缺失主要影響干面條斷裂強(qiáng)度。

通過比較發(fā)現(xiàn)，單缺失類型條件下，影響煮熟面條拉伸參數(shù)嚴(yán)重程度為 Wx-A1缺失類型≥Wx-B1缺失類型＞W(wǎng)x-D1缺失類型；雙缺失條件下，以Wx-B1和Wx-D1同時(shí)缺失時(shí)為最優(yōu)；當(dāng)三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)缺失時(shí)，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。因此，在雙缺失條件下，Wx-B1亞基位點(diǎn)是否缺失是影響面條品質(zhì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)的重要因素。在優(yōu)質(zhì)專用小麥品種選育過程中，要考慮不同 Wx亞基組合類型對(duì)淀粉品質(zhì)及面條品質(zhì)的影響。

4 結(jié)論

不同Wx蛋白亞基位點(diǎn)缺失對(duì)小麥直、支鏈淀粉含量影響的程度不同。雙缺失類型之間直、支鏈淀粉含量都沒有顯著差異，突變型和其他組合相比達(dá)顯著差異。雙缺失組合中存在 Wx-B1缺失位點(diǎn)時(shí)對(duì)面條干面條斷裂強(qiáng)度影響較大，不易斷裂。影響煮熟面條拉伸參數(shù)，單缺失組合為 Wx-A1≥Wx-B1＞W(wǎng)x-D1，雙缺失組合中Wx-B1和Wx-D1同時(shí)缺失時(shí)面條拉伸表現(xiàn)最優(yōu)；全缺失時(shí)，主要影響煮熟面條的拉伸距離，其次是曲線面積和拉伸力。