不同氮磷比對斜生柵藻生長的影響

楊小峰 張 靜 張沁榮

（1.忻州師范學院 山西忻州 034000；2.忻州市環境保護研究所 山西忻州 034000；3.南京師范大學 江蘇南京 210000）

一、研究背景及現狀

我國淡水資源嚴重不足，制約著經濟社會的可持續發展，其中水資源時空分布不均是主要原因，另外水資源綜合利用率低，浪費和污染嚴重，特別是隨著工業和農業的發展，以及水產養殖業發展，湖泊外源輸入性營養鹽劇增，農業化肥大量使用，城鎮生活污水的直接排放，飼料中營養鹽的大量投入，使得水體富營養化問題日益突出，成為威脅湖泊水體和水庫水質的主要因素。水體富營養化的危害是多方面的。水體富營養化會使得水生態系統結構和功能嚴重受損，藍、綠藻水華頻發，破壞水生態系統的穩固性，減少水環境中的生物多樣性，破壞生態景觀，造成水生動物的大量死亡。嚴重時，會成為制約發展中國家可持續發展的重要因素，進而引起一系列巨大的經濟損失，威脅人類的生存和發展。

水體富營養化的形成原因是復雜的。其中水體中營養鹽的富集是引起水華爆發的直接導火索。而氮（N）磷（P）是引起藻類生長的主要生態因子。在我國，湖泊分布跨度較大，南北不同湖泊的水體富營養化程度不同。在南方地區的湖泊水體富營養化程度高，多發生由毒性微囊藻，舟形藻等藍藻造成的水華現象，在我國北方地區主要是小球藻、柵藻、席藻等綠藻造成。目前，人們對于湖泊水體生長中氮磷元素的影響研究已經取得一定進展。但是水華現象的研究集中于水華頻發的南方湖泊，對北方地區水華現象的研究甚少。

斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），又稱斜生柵列藻，屬于綠藻門，綠球藻目，柵藻科，柵藻屬，主要分布于我國北方靜水水體中，是引起綠藻水華的主要無毒性藻種。斜生柵藻含有蝦青素和細胞內含豐富的蛋白質，可作為水生動物飼料；對氮磷有一定的耐受性，可作為評價水質的指示生物；對氮磷元素去除率高，對重金屬有良好的吸附性，因此可用于廢水處理。自身還具有較高的油脂含量，可作為生物柴油。尤其是在夏季，斜生柵藻是湖泊、水庫、池塘、沼澤等靜水水體中的優勢藻種，其具有易存活、繁殖能力強、環境耐受性強、氮磷利用率高等特點。綜上所述：本文通過實地考察與查找相關文獻確定將斜生柵藻作為實驗藻種。

二、研究目的和意義

在藻類生長過程中，氮、磷為其生長的必要生態因子。氮為藻類蛋白質和葉綠素的主要組成成分之一，而磷元素會直接參與藻類光合作用的各個環節，水體中氮磷的含量會直接影響到藻類生長與葉綠素含量，且葉綠素a可作為藻類生物量的表征，藻密度可作評價水環境富營養的指標。因此，根據文獻研究成果以及預實驗的方法，設置了五個氮磷比梯度，分別為N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1，在實驗室條件下對斜生柵藻進行為期兩周培養，同時每一濃度設置三個平行實驗組，測定不同階段藻液細胞密度，并測量葉綠素a的含量，分析不同氮磷比對斜生柵藻生長的影響，確定斜生柵藻生長的最適氮磷濃度。為掌握富營養化水體藻類的生長規律，監控淡水水華爆發和指導生態修復富營養化藻華水體提供數據支持。

三、材料與方法

（一）實驗材料

1.實驗藻種

實驗培養藻種為斜生柵藻。

2.主要儀器

AL204電子天平：梅特勒托利多儀器（上海有限公司）；BXM-30R立體壓力蒸汽滅菌器：

上海博訊實業有限公司醫療設備廠；RZH-800A智能人工氣候箱：杭州匯爾儀器設備有限公司；DK2000igital數碼顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；UV2200紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；1850R低速小型臺式低溫冷凍離心機：恒力離心機械設備有限公司；R300A實驗室真空抽濾裝置：上海領德儀器有限公司。

3.主要試劑

硝酸鈉、焦磷酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸（EDTANa2）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、蒸餾水、氯化鈣CaCl2·2H2O、碳酸鈉Na2CO3、硼酸H3BO3、四水氯化錳MnCl·4H2O、硫酸鋅ZnSO4、二水合鉬酸鈉、無水硫酸銅：天津市風船化學試劑科技有限公司。以上試劑均為分析純。

4.培養基配制

本實驗以未加入氮磷的BG-11培養基為基礎，配置為不含氮磷的Stock1、Stock3、Stock4、Stock5。再根據實驗氮磷梯度配置不同濃度的Stock2。其中培養基的主要氮源為硝酸鈉（NaNO3），主要的磷源為焦磷酸鈉（Na4P2O7·10H2O），通過調整Stock2中Na4P2O7·10H2O的取量，從而設置N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1五個氮磷比梯度，分別對藻類進行培養，同時每組設置三個平行。

配制過程：

Stock1：稱取0.3 g檸檬酸；0.3 g檸檬酸鐵銨；0.05 g EDTANa2溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock2：稱取3 g NaNO3；0.15 g MgSO4·7H2O；Na4P2O7·10H2O（變量）溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock3：稱取0.19 g CaCl2·2H2O溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock4：稱取2 g Na2CO3溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock5：稱取0.286 g H3BO3；0.181 g MnCl·4H2O；0.0222 g ZnSO4；0.0021 g·NaMoO4·2H2O；0.008 g CuSO4·5H2O溶于蒸餾水中，定容至100 mL。具體操作：量取2 mL的Stock1；20 mL的Stock2；2 mL的Stock3；1 mL的Stock4；1 mL的Stock5混合溶于蒸餾水中，定容到1 000 mL。

表1 培養液中磷濃度梯度

（二）實驗方法

1.藻的培養

本實驗藻類的培養采取批量培養方法。選用15個500 mL錐形瓶，進行清洗、烘干、高壓滅菌。將不同氮磷比的300 mL培養液倒入錐形瓶中，每個濃度設置3個平行組，加入3 mL斜生柵藻液，封口膜封口后放入人工氣候培養箱中。在溫度為25 ℃，光照強度約為50μmol/（m2·s），光暗比為12:12的條件下培養兩周。每天充分搖瓶3～4次并依次變換位置。所有操作均在無菌超凈臺完成。

2.生物量的測定

從接入藻種的第二天起，每隔一日于當天19:00測定生物量。將藻液搖勻后取少量，用血球計數板于光學顯微鏡下進行觀察計數。此過程連續重復七次持續觀察。

具體操作：

（1）先用自來水沖洗血球計數板，再用95%乙醇棉球輕輕擦洗后用水沖洗，最后用吸水紙吸干。蓋玻片也作同樣的清潔處理。

（2）將藻液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓藻液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液，然后加蓋蓋玻片。

（3）靜置片刻，待藻液自然沉降與穩定后，可在顯微鏡下計數。在低倍鏡下尋找計數板大方格網，再在大方格網中央尋找計數室并將其移至視眼中央，轉用高倍鏡觀察和計數。

（4）計數區是由25個中方格組成，按對角線方位，數左上a、左下b、右上c、右下d、中央e，5個中方格的藻數。為了保證計數的準確性，避免重復計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計統一的規定。菌體位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。

（5）每個樣品重復計數2～3次（每次數值不應相差過大，否則重新操作），用Excel統計分析數據并按公式計算出每mL藻懸液所含細胞數量。

（6）測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，自行晾干后，放入盒內保存。

3.葉綠素a 的提取測定

本操作使用丙酮手動研磨浸泡法。以90%丙酮為提取液，使用玻璃纖維濾膜抽濾收集斜生柵藻，避光研磨提取藻中葉綠素，在研磨浸泡后，經過冷凍離心機離心，測定其750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波長下的吸光度值，計算葉綠素a的含量。

三、討論與結論

（一）討論

潘非斐，吳楠在研究不同氮磷比對福建沿海米氏凱倫藻生長的影響中得出：海米氏凱倫藻在N:P=32條件下比生長率最快；雷鵬，孫成渤對水華微囊藻進行19天的批量培養得出：微囊藻在N/P=16條件下，生長繁殖情況最好。孫軍，劉東艷在研究不同氮磷比率對青島大扁藻、新月柱鞘藻和米氏凱倫藻生長影響時得出：新月柱鞘藻在N:P=160時細胞比生長速率最快，而青島大扁藻和米氏凱倫藻分別在4:1和80:1的條件下比生長速率最快[26]。薄香蘭，劉興，竇勇等人在研究不同氮磷比對小球藻葉綠素熒光參數及生長的影響時得出：小球藻在N:P為17.30:1生長最好。

本實驗在使用B G-1 1 培養基模擬自然水體培養斜生柵藻時得出:斜生柵藻在批量連續培養14天，在N:P=16的情況下藻類細胞密度最大，為17.53×104個/mL，生物量為40.11 mg/m3。在N:P=32的情況下藻類細胞密度最小。

因此可以通過調節水體中氮磷比來預防或治理斜生柵藻引起的水華。在N:P=4的實驗組培養10天后，葉綠素a出現急速下降，可能是由于實驗室培養條件使其在達到最大值后，種間競爭激烈出現大量死亡而造成的。其具體原因還有待進一步研究。

（二）結論

氮磷元素為藻類生長的必要元素，氮磷營養鹽在水體中的比例也成為水華爆發的關鍵。在主要由斜生柵藻引發的水體富營養化中，不同氮磷比對藻類生長影響的探究就尤為重要。通過以上實驗測定，可以得出：

1.斜生柵藻的生長情況與培養基初始氮磷比有顯著的相關性。不同氮磷比下斜生柵藻的生長情況不同。

2.斜生柵藻最適生長N：P為16:1，即當磷含量為505.8 mg氮含量為3 000 mg，在實驗室條件下培養12天時，細胞密度可達到最大，為17.53×104個/mL，生物量為40.11 mg/m3。其后依次為N:P=4:1，N:P=8:1，N:P=20:1，N:P=35:1。