過表達和沉默NbRbcS基因對煙草主要病毒侵染的影響

羅健達 劉笑瑋 宋麗云 李瑩 申莉莉 盧燕回 李永亮 李斌 王鳳龍 楊金廣

摘? 要：為明確Rubisco酶小亞基（Rubisco small subunit，RbcS）在煙草抵抗主要病毒侵染脅迫中的作用，以本氏煙為研究材料，利用qRT-PCR、Western blot和瞬時表達體系對煙草RbcS基因在TMV、CMV和PVY侵染中的調控作用進行系統分析。結果表明，3種病毒侵染本氏煙均引起NbRbcS在mRNA水平和蛋白水平上下調，瞬時過表達NbRbcS，病毒拷貝數均顯著降低。而沉默NbRbcS，TMV、CMV和PVY拷貝數分別達到陰性對照的11.12、9.57和17.76倍。對PVY引起的斑駁葉片中深綠色和淺綠色區域分別進行qRT-PCR分析發現，在淺葉區NbRbcS mRNA的表達量只有深葉區的49.10%，但PVY的拷貝數卻達到了深葉區的5.18倍。以上研究表明，RbcS大量表達可增強煙草對病毒的防御能力，煙草RbcS基因可作為潛在的抗病毒基因利用。

關鍵詞：煙草;RbcS基因;脅迫響應;TMV;CMV;PVY

Abstract： In order to clarify the role of Rubisco small subunit （RbcS） in tobaccos resistance to major virus infection， using Nicotiana benthamiana as the main research material， the regulatory role of the RbcS gene in TMV， CMV and PVY infection was systematically analyzed. The results showed that the infecting of the three viruses all caused down-regulation of NbRbcS expression at the mRNA and protein levels. Transient over-expression of NbRbcS significantly reduced the copy number of TMV， CMV and PVY. When the NbRbcS gene was silenced， the copy number of the three viruses all increased significantly， reaching 11.12 times， 9.57 times， and 17.76 times of the negative controls. The dark and light green area of mottled leaves caused by PVY were analyzed by qRT-PCR. The results showed that in the light green leaf areas， the expression of NbRbcS mRNA was only 49.10% of the dark green leaf areas， but the copy number of PVY was 5.18 times of that in the dark green leaf areas. The above results indicated that over-expression of RbcS can enhance the defense ability of tobacco against viruses. The tobacco RbcS gene can be used as a potential anti-virus gene.

Keywords： tobacco; RbcS gene; stress response; TMV; CMV; PVY

煙草病毒病是危害煙草的主要病害之一，每年給煙葉產區造成巨大的損失[1-2]。我國發現20余種病毒可侵染煙草[3-4]，其中煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染我國煙草的主要病毒種類[5-6]。病毒侵染植物后引起的葉片褪綠、斑駁、畸形、壞死等是最典型和常見的癥狀[7-8]，這反映出病毒破壞了葉綠體的結構和光合色素，調控了葉綠體蛋白的表達[9]。葉綠體是植物光合作用的場所，也是眾多植物病毒侵染時共同攻擊的目標，在病毒侵染植物時扮演著重要而復雜的角色[10]。核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）定位于葉綠體中，是植物葉片中含量最豐富的可溶性蛋白[11]。Rubisco是一種雙功能酶，既是光合作用中卡爾文循環的關鍵酶，也是光呼吸反應中的第一個酶，通過雙向催化可以調控光合作用和光呼吸的效率，從而決定凈光合效率[12]。Rubisco酶由8個大亞基RbcL（Rubisco larges subunit）和8個小亞基RbcS（Rubisco small subunit）組成[13]。RbcL上含有豐富的Rubisco酶催化位點和活化位點，但RbcL的表達量及Rubisco酶的組裝和活性依賴于RbcS的調控[14]。在高等植物中，RbcL由葉綠體基因組編碼，而RbcS由核基因編碼[15]。由于RbcL上活性位點較多，眾多學者的研究焦點都聚集在RbcL上，忽視了RbcS在Rubisco酶結構和功能中的作用[16]。前人研究表明RbcS蛋白參與植物抗逆信號的傳導過程，在植物生長各環節均發揮著重要作用[17]。賀超英等[18]研究表明，RbcS基因對外界不同處理（如水楊酸、氯化鈉、低溫和干旱等）具有明顯的應答效應。本研究主要探討NbRbcS基因對RNA病毒侵染煙草的應答變化，并且分析其過表達和沉默表達對病毒侵染脅迫的影響，以期進一步揭示植物RNA病毒的致病機理。

1? 材料與方法

1.1? 試驗時間、材料

試驗于2019年3月至2020年5月在中國農業科學院煙草研究所植物保護研究中心進行。PVYN、TMV-U1、CMV-Fny病毒株系，侵染性克隆PVY-GFP、TMV-GFP由本實驗室提供。本氏煙（Nicotiana benthamiana）生長條件：溫度25 ℃，濕度60%，光暗周期16 h/8 h，光照強度2000 lux，滅菌基質營養土培養。

1.2? 植物表達載體構建

基于酶切位點AhdI設計引物pGWC-RbcS-F/R（表1），擴增NbRbcS CDS（登錄號：LN877373.1），一步克隆法連接至pGWC載體。利用LR重組酶（Invitrogen）反應得到過表達載體pEarleyGate100-RbcS。基于pTRV2的酶切位點EcoRI、KpnI，設計引物pTRV2-RbcS-F/R，擴增NbRbcS CDS，一步克隆法得到沉默載體pTRV2-RbcS。重組載體轉化至大腸桿菌感受態細胞Trans1T-1（TransGen Biotech）。挑取單克隆，測序，陽性克隆轉至農桿菌感受態細胞LBA4404（TransGen Biotech）。本試驗引物合成及測序均由派森諾生物科技有限公司完成。

1.3? 試驗設計

1.3.1? TMV、CMV、PVY侵染本氏煙對NbRbcS表達的影響? 以摩擦PBS（磷酸鹽緩沖溶液）為陰性對照，用摩擦接毒法，分別接種TMV、CMV、PVY于6周齡本氏煙第7葉。由于3種病毒發病規律不一樣，分別于病毒侵染后第6、7、8天取系統葉（第11葉及以上葉片，后同），取3個重復，液氮速凍，?80 ℃保存。

1.3.2? 過表達NbRbcS對TMV、CMV、PVY侵染本氏煙的影響? 將含pEarleyGate100-RbcS與pEarleyGate100農桿菌活化培養，重懸菌液至OD600值為1.0，暗中靜置3 h。以浸潤pEarleyGate100農桿菌為陰性對照，用pEarleyGate100-RbcS農桿菌浸潤6周齡本氏煙第7、11葉。12 h后，分別在第7片浸潤葉上接種TMV、CMV、PVY。分別于浸潤后第3、4、5天取第11葉，取3個重復，液氮速凍，?80 ℃保存。

1.3.3? 沉默NbRbcS對TMV、CMV、PVY侵染本氏煙的影響? 將菌液pTRV1與pTRV2-RbcS 1：1混合浸潤4周齡本氏煙第6葉，以pTRV1與pTRV2 1：1混合處理為陰性對照。于14 d取系統葉，檢測沉默效率后，將TMV、CMV、PVY分別接種于第9葉。分別于接種后3、4、5天取系統葉，取3個重復，液氮速凍，?80 ℃保存。

用TMV-GFP與PVY-GFP侵染沉默NbRbcS的本氏煙及陰性對照，分別于侵染3 d和6 d后在手持長波紫外燈下觀察病毒熒光表達情況。

1.3.4? PVY引起的斑駁花葉中NbRbcS與PVY的表達情況分析? 取PVY侵染30 d有明顯斑駁的葉片，利用解剖刀將斑駁葉根據綠色深淺分離，分別置于液氮中速凍保存。

1.4? 相對熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

利用TRIzol法提取本氏煙總RNA，HiScriptII Q Select RT SuperMix for qPCR（Vazyme）反轉錄，合成cDNA。以各樣品cDNA為模板，NbActin為內參基因，根據試劑盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）說明配制反應體系，置于Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中完成qRT-PCR反應。反應程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40循環;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。利用2-△△CT法計算相對表達量，獨立樣本T檢驗法進行數據差異性檢驗分析。NbRbcS，NbActin與3種病毒定量檢測引物詳見表1。

1.5? 蛋白質印跡法（Western Blot， WB）分析NbRbcS表達量差異

將試驗1.3.1所取樣品在液氮中充分研磨，1 g研磨組織加1 mL蛋白裂解液（北京康為世紀生物科技有限公司生產），冰上裂解30 min，4 ℃離心20 min，取上清棄沉淀，得植物總蛋白。經SDS-PAGE電泳及200 mA濕法轉膜90 min，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜（Bio-Rad）置于含5% BSA的TBST封閉2 h。PVDF膜用RbcS抗體（Agrisera，兔源）與Actin抗體（Phytoab，鼠源）4 ℃過夜孵育，對應二抗室溫孵育1 h。將發光底物工作液加在PVDF膜上，置于化學發光成像系統（Tanon 5200）內檢測目的蛋白條帶。

2? 結? 果

2.1? 病毒侵染對煙草NbRbcS基因表達的影響

本氏煙接種TMV、CMV、PVY后，系統葉初期產生褪綠畸形癥狀（圖1）。將試驗1.3.1所取樣品進行qRT-PCR分析，結果顯示（圖2），TMV、CMV、PVY侵染本氏煙均能引起NbRbcS mRNA表達下調，分別下調59.55%，36.71%，64.24%，差異顯著（p<0.05）。蛋白水平的檢測結果與RNA水平一致（圖3），TMV、CMV、PVY處理后，系統葉中NbRbcS蛋白的表達量均低于對照組，該結果表明病毒侵染煙草可抑制NbRbcS表達。

2.2? 瞬時過表達NbRbcS對煙草主要病毒侵染復制的影響

為驗證NbRbcS對主要病毒侵染復制的影響，對試驗1.3.2所取樣品中TMV、CMV和PVY進行qRT-PCR分析。由圖4可見，瞬時過表達NbRbcS能夠抑制病毒侵染復制，使TMV、CMV、PVY的拷貝數分別下調33.25%、33.13%、51.66%，差異顯著（p<0.05），該結果表明本氏煙NbRbcS蛋白具有潛在的抗病毒特性。

2.3? 沉默NbRbcS對煙草主要病毒侵染復制的影響

利用VIGS（病毒介導的沉默系統）沉默NbRbcS，沉默效率達到72.11%（圖5），沉默NbRbcS本氏煙的系統葉明顯地黃化褪綠，類似病毒侵染初期的明脈褪綠癥狀（圖6）。接種TMV、CMV、PVY后，對系統葉病毒拷貝數進行qRT-PCR分析，TMV、CMV、PVY相對拷貝數分別是對照組的11.12倍，9.57倍，17.76倍，差異極顯著（p<0.01）（圖7）。

接種PVY-GFP 6 d，沉默NbRbcS的本氏煙系統葉病毒熒光面積顯著大于陰性對照（圖8）。接種TMV-GFP 3 d，沉默NbRbcS的本氏煙的接種葉上平均有61.33個病毒熒光斑點，而對照組平均只有25.67個，處理組是對照組的2.38倍，差異顯著（p<0.05）。結果表明NbRbcS能抑制煙草病毒侵染復制。

2.4? PVY侵染本氏煙形成的斑駁花葉中NbRbcS與PVY的表達分析

為探究病毒侵染后斑駁花葉癥狀與寄主NbRbcS表達的關系，本研究以PVY侵染本氏煙30 d的葉片為研究材料，此時葉片出現嚴重斑駁、畸形等癥狀（圖9），對斑駁葉深色區和淺色區的PVY 和NbRbcS表達量進行qRT-PCR分析。結果表明，在淺葉區NbRbcS表達量只有深葉區的49.10%（圖10），但PVY的拷貝數卻達到深葉區的5.18倍，上述結果表明病毒侵染后產生的斑駁花葉癥狀與NbRbcS表達密切相關。

3? 討? 論

植物受到生物脅迫和非生物脅迫時，體內會發生一系列生理生化變化，進而增強其耐受力或抵御力[19-20]。干旱脅迫下葉片中光合作用相關蛋白表達量發生變化，以抵御干旱脅迫[21]。干旱脅迫使植物Rubisco酶活性降低，RbcL和RbcS表達量降低，而在耐旱材料中RbcL和RbcS表達量較高[22]。HU等[23]發現調整營養液NH4+∶NO3?比例，可提高白菜RbcL、RbcS等基因的表達量，白菜在弱光條件下的光合作用增強，碳水化合物的積累增加，耐弱光能力提升。本試驗過表達NbRbcS基因可降低TMV、PVY和CMV的拷貝數，進一步說明RbcL和RbcS基因能提高植物抗逆能力。

干旱脅迫、鹽脅迫等會影響Rubisco酶活性及表達 [24-25]，學者對Rubis-co酶響應非生物脅迫的研究較深入，而在生物脅迫中研究較少[26-27]。ZHAO等[28]發現NbRbcS能夠與番茄花葉病毒（ToMV）多功能運動蛋白互作;沉默本氏煙NbRbcS能增強ToMV在接種葉的感染;在抗ToMV轉基因本氏煙中沉默NbRbcS，則降低了其抗性。沉默NbRbcS，ToMV能有效地局部感染，但不能系統地移動。本研究發現沉默NbRbcS同樣顯著降低了本氏煙對TMV、PVY和CMV的御防能力，但不影響病毒的系統移動。推測RbcS通過與病毒蛋白互作，影響病毒蛋白功能，從而提高植物對病毒的防御能力。前人研究表明，病毒能降低Rubisco酶活性[29]，改變宿主葉綠體的結構，影響其功能，甚至可以利用葉綠體進行復制增殖，表明葉綠體與病毒的生命周期密切相關[30]。RbcS是葉綠體的主要可溶性蛋白之一，可調節Rubisco酶活性，對于葉綠體發揮功能有重要作用。推測RbcS的大量表達利于Rubisco酶發揮功能，維持光合作用的穩定，為防御代謝提 供物質保障，限制病毒活動。

雖然RbcS過表達可以增強植物對病毒的抵御能力，但病毒同樣進化出反抑制機制，TMV、PVY和CMV侵染均導致NbRbcS表達下調，進而利于病毒的大量復制和花葉的形成。但斑駁花葉的形成是由于寄主為限制病毒的猖獗擴繁，提高局部NbRbcS的表達來抵御病毒，以維持較高光合效率 導致;還是病毒為持續獲得較好營養條件，與寄主更好地共生而局部減弱對RbcS的降解調控所致，有待深入研究。RbcS在防御病毒過程中怎樣起作用，病毒通過何種途徑調控RbcS的表達，也需要深入研究闡明。

4? 結? 論

本研究結果表明，本氏煙NbRbcS基因在抵御煙草主要病毒侵染中發揮重要作用。過表達NbRbcS蛋白，能抑制TMV、PVY和CMV 3種病毒的復制增殖。而沉默NbRbcS，則極顯著地增強3種病毒對本氏煙的侵染能力。TMV、PVY和CMV侵染均可降低本氏煙NbRbcS在基因和蛋白水平的表達量。PVY引起的斑駁葉片中，淺葉區病毒聚集且RbcS基因表達受到抑制，表明病毒引起的葉片斑駁可能與調控RbcS表達有關。研究結果有助于進一步理解植物病毒的致病機理和植物抗病毒機制，并為病毒病的防控提供新思路。

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