馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白抗原表位分析及其快速ELISA檢測(cè)方法的建立

梁雨欣，吳建祥，李小宇，張春雨，侯吉超，周雪平,，王永志,

馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白抗原表位分析及其快速ELISA檢測(cè)方法的建立

梁雨欣1,2，吳建祥3，李小宇2，張春雨2，侯吉超1，周雪平3,4，王永志2,4

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)春 130033；3浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州 310058；4中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193

【】馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病毒之一，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的防治藥劑，脫毒種薯的應(yīng)用是預(yù)防PVY危害的主要防治措施。建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的PVY快速檢測(cè)方法，為脫毒種薯質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。將PVY衣殼蛋白（coat protein，CP）分段表達(dá)為有重疊部分的小段多肽，以其為抗原通過(guò)Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)常規(guī)雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）對(duì)識(shí)別不同抗原表位的單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）進(jìn)行配對(duì)試驗(yàn)，篩選一組檢測(cè)效果最優(yōu)的配對(duì)單克隆抗體，并確認(rèn)捕獲抗體和檢測(cè)抗體。通過(guò)方陣滴定法確定捕獲抗體及檢測(cè)抗體的最佳工作濃度，通過(guò)控制變量法確定檢測(cè)抗體與抗原的最佳共同孵育時(shí)間。以不同濃度的PVY-CP蛋白為抗原，檢驗(yàn)快速DAS-ELISA的靈敏度。以感染不同病毒的馬鈴薯樣品為抗原，檢測(cè)快速DAS-ELISA的特異性。同時(shí)通過(guò)快速DAS-ELISA與RT-PCR檢測(cè)50份田間采集的疑似感染PVY的馬鈴薯樣品，將二者結(jié)果相比較檢驗(yàn)檢測(cè)方法的符合率。運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA對(duì)不同株系PVY感染的馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)。利用PVY-CP的6條分段表達(dá)多肽篩選到一組能進(jìn)行DAS-ELISA的配對(duì)單克隆抗體（9G6和3D3），并以這對(duì)單抗為基礎(chǔ)建立了PVY快速DAS-ELISA檢測(cè)方法。以9G6為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，檢測(cè)抗體3D3經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記后以2 μg·mL-1的工作濃度與抗原在37℃共同孵育5 min。該檢測(cè)方法檢測(cè)限為0.5 ng·mL-1，特異性分析結(jié)果顯示該法僅在檢測(cè)感染PVY的馬鈴薯樣品時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng)，檢測(cè)馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf-roll virus，PLRV）等其他常見(jiàn)馬鈴薯病毒樣品均呈陰性反應(yīng)。通過(guò)快速DAS-ELISA與RT-PCR同時(shí)對(duì)50份田間采集的馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)，有48份樣品檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)96%，且對(duì)PVYN及PVYO樣品檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。建立的PVY檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，30 min即可完成檢測(cè)，方便快捷，為PVY的高通量檢測(cè)、脫毒種薯的生產(chǎn)提供了關(guān)鍵技術(shù)支持。

馬鈴薯Y病毒；單克隆抗體；抗原表位；雙抗夾心ELISA

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界第四大糧食作物，2015年中國(guó)提出馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略，目前中國(guó)是馬鈴薯第一大生產(chǎn)國(guó)[1-2]。已知能侵染馬鈴薯的病毒至少有53種，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)10余種[3]。其中，馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是侵染范圍最廣也是造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的病毒之一[4-5]。PVY于1931年在馬鈴薯中首次被發(fā)現(xiàn)[6]，目前在世界各地均有發(fā)生[7-11]。在自然條件下PVY可通過(guò)蚜蟲(chóng)以非持久性方式傳播，同時(shí)也可以通過(guò)汁液摩擦、嫁接等機(jī)械方式傳播。PVY單獨(dú)侵染馬鈴薯可引起葉面黃化褪綠、皺縮、葉脈壞死等癥狀，且由于帶毒薯塊自身無(wú)法清除病毒，病毒會(huì)逐代傳播積累最終導(dǎo)致馬鈴薯種質(zhì)退化，若與其他病毒復(fù)合侵染可造成馬鈴薯高達(dá)80%的減產(chǎn)[12-15]。由于尚未發(fā)現(xiàn)有效的病毒病防治藥劑，高質(zhì)量的脫毒種薯成為病毒病的重要防治措施，而快速、高效的病毒檢測(cè)技術(shù)是種薯質(zhì)量控制的關(guān)鍵。【前人研究進(jìn)展】目前常用的PVY檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)法、電子顯微鏡檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法和血清學(xué)檢測(cè)法[16]。生物學(xué)檢測(cè)法和電子顯微鏡檢測(cè)法都需要培養(yǎng)或制備合適的觀察對(duì)象，耗時(shí)較長(zhǎng)且結(jié)果判定較為主觀，并不適用于快速檢測(cè)。以高靈敏度為優(yōu)點(diǎn)的RT-PCR是近年來(lái)常用于PVY檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)法，而CP基因以其高保守性成為RT-PCR擴(kuò)增的首選基因，其表達(dá)的CP蛋白亦是血清學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)的首選蛋白。李玉琦等[17]針對(duì)PVY-CP保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)馬鈴薯帶病種薯和植株中PVY含量的RT-PCR檢測(cè)方法。雖然RT-PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)對(duì)RNA的提取、cDNA的反轉(zhuǎn)錄要求較高，不適用于高通量樣品檢測(cè)。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是目前最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法之一，具有高通量、不依賴特定儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。早在1981年，張鶴齡等[18]利用提取的PVY病毒免疫家兔，制備了PVY多克隆抗體，并檢測(cè)了煙草中的PVY，然而可檢測(cè)的感病汁液最高稀釋度僅為1﹕100；1993年，Singh等[19]制備了多株P(guān)VY抗體，并以特異性最佳的單克隆抗體為基礎(chǔ)建立了dot-ELISA，對(duì)馬鈴薯葉片中PVYN進(jìn)行檢測(cè)，最高稀釋度為1﹕640；2008年，高方方等[20]通過(guò)PVYN株系分離物CP重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備了PVY兔血清，建立了PVY間接ELISA并對(duì)煙草中的PVY進(jìn)行檢測(cè)，最高稀釋度為1﹕128；2016年，宋革等[21]制備了4株P(guān)VY單克隆抗體，以其為核心建立了ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 4種血清學(xué)檢測(cè)方法，靈敏度極高但檢測(cè)步驟繁瑣。【本研究切入點(diǎn)】前期雖有部分研究者制備了PVY特異性抗體，但甚少有應(yīng)用方面的報(bào)道。而已建立的血清學(xué)檢測(cè)方法，由于靈敏度較低，試驗(yàn)流程較為繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速高通量的檢測(cè)需求?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)PVY-CP的分段表達(dá)多肽篩選到一組能進(jìn)行夾心ELISA的配對(duì)單克隆抗體（9G6和3D3），并以這對(duì)單抗為基礎(chǔ)建立PVY快速DAS-ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化DAS-ELISA工作條件，將樣品和檢測(cè)抗體同時(shí)加入酶標(biāo)板共同孵育，簡(jiǎn)化操作步驟并縮短試驗(yàn)時(shí)間，從而提高檢測(cè)效率，為PVY的快速檢測(cè)、診斷及脫毒種薯的生產(chǎn)提供關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料與試劑

PVY病毒、大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存，PVY單克隆抗體3D3、9G6為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室制備，PVY單克隆抗體3E4為浙江大學(xué)制備；限制內(nèi)切酶R I、I，In-Fusion? HD Cloning Kit均購(gòu)自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；RNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；雙組分TMB顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；脫脂奶粉、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

洗板機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 PVY-CP蛋白抗原表位分析

將PVYCP基因分段表達(dá)為6條多肽：PVY-CP1-180、PVY-CP90-281、PVY-CP1-59、PVY-CP31-89、PVY-CP90-148和PVY-CP120-180，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RI和I雙酶切pGEX-6p-1載體，同時(shí)對(duì)目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切載體大片段進(jìn)行膠回收，通過(guò)In-Fusion試劑盒將二者連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)PVY-CP1-180、PVY-CP90-281、PVY-CP1-59、PVY-CP31-89、PVY-CP90-148和PVY-CP120-1806條多肽。以表達(dá)的多肽進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜，MAb（雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清）為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗，通過(guò)Western blot分析MAb所識(shí)別的抗原表位。

表1 PVY-CP蛋白分段表達(dá)引物

：R I酶切位點(diǎn)R I restriction enzyme cutting site；：I酶切位點(diǎn)I restriction enzyme cutting site

1.4 MAb HRP標(biāo)記

采用簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法對(duì)MAb進(jìn)行HRP標(biāo)記，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[22]。

1.5 快速ELISA檢測(cè)方法的建立

捕獲抗體100 μL/孔，包被酶標(biāo)板；加入5%脫脂奶280 μL/孔，37℃封閉30 min；將待測(cè)樣品按1﹕10（W/V，g·mL-1）比例加入0.01 mol·L-1PBS緩沖液研磨后離心取上清，以上清為溶劑稀釋檢測(cè)抗體，將混合液加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，37℃靜置孵育；以上每一步結(jié)束后TBST洗板3次；TMB顯色液100 μL/孔，避光顯色5—10 min后加入2 mol·L-1H2SO4溶液50 μL/孔，終止反應(yīng)；在450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。以P（待測(cè)抗原OD450值）/N（陰性抗原OD450值）≥2.1判定檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.6 快速ELISA工作條件的優(yōu)化

分別以健康馬鈴薯、感染PVY馬鈴薯的葉片研磨上清液為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，運(yùn)用常規(guī)DAS-ELISA程序進(jìn)行3株P(guān)VY MAb的配對(duì)，以P/N最大值對(duì)應(yīng)的抗體組合為工作抗體。采用方陣法確定抗體工作濃度；通過(guò)控制變量法分別對(duì)捕獲抗體包被條件、待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體混合液孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以P/N最大值確定捕獲抗體包被條件及待測(cè)樣品和檢測(cè)抗體共同孵育時(shí)間。

采集感染PVY的馬鈴薯葉片，0.01 mol·L-1PBS緩沖液為研磨液充分研磨，將葉片按質(zhì)量體積比從1﹕10（1 g=10 mL）倍比稀釋至1﹕5 120，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，運(yùn)用優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，得出葉片最佳檢測(cè)范圍的稀釋倍數(shù)。

1.7 檢測(cè)靈敏度分析

以0.01 mol·L-1PBS緩沖液為稀釋液將PVY-CP蛋白從10 000 ng·mL-1稀釋至0.05 ng·mL-1，運(yùn)用優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，繪制靈敏度曲線[23]。

1.8 特異性分析

利用優(yōu)化后的PVY快速DAS-ELISA對(duì)PVY馬鈴薯薯塊及葉片、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf-roll virus，PLRV）葉片進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品3個(gè)重復(fù)，根據(jù)P/N值≥2.1為陽(yáng)性檢驗(yàn)檢測(cè)方法的特異性。

1.9 符合率檢測(cè)

對(duì)吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地隨機(jī)采集的50份疑似感染PVY的馬鈴薯樣品，運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA及RT-PCR分別進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果，對(duì)檢測(cè)方法的符合率進(jìn)行檢驗(yàn)。按照RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取馬鈴薯葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)PVY檢疫鑒定方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36816—2018）合成用于擴(kuò)增PVY的RT-PCR簡(jiǎn)并引物，PVY-a1-F420：5′-CGATACAAG ACTGATGYCCAGAT-3′；PVY-a1-R1200：5′-TAYTGT TGRGCACAGGTRGGG-3′。PCR條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳，并送往吉林省庫(kù)美科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.10 不同株系馬鈴薯樣品檢測(cè)

運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的不同株系PVY（PVYN與PVYO）感染的馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MAb識(shí)別抗原表位分析

如圖1所示，共表達(dá)了6條多肽，首先將PVY-CP蛋白分段表達(dá)為有重疊部分的兩條肽段：PVY-CP1-180與PVY-CP90-281，通過(guò)Western blot分析MAb 3D3、3E4、9G6識(shí)別的抗原表位，結(jié)果如表2所示，3D3對(duì)兩條肽段均有識(shí)別，即3D3識(shí)別的抗原表位位于兩條肽段的重疊部分：PVY-CP90-180，同理可知9G6識(shí)別的抗原表位亦位于PVY-CP90-180。而3E4僅識(shí)別PVY-CP1-180，不識(shí)別PVY-CP90-281，即3E4識(shí)別的抗原表位位于PVY-CP1-90。由此得知，3株MAb識(shí)別的抗原表位均集中在PVY-CP1-180。進(jìn)一步分析抗原表位，繼續(xù)將PVY-CP1-180分段表達(dá)為PVY-CP1-59、PVY- CP31-89、PVY-CP90-148、PVY-CP120-1804條多肽，仍通過(guò)Western blot分析MAb 3D3、3E4、9G6識(shí)別的抗原表位，結(jié)果如表2，最終發(fā)現(xiàn)3D3識(shí)別的抗原表位位于PVY-CP120-148，3E4識(shí)別的抗原表位位于PVY- CP31-59，9G6識(shí)別的抗原表位位于PVY-CP90-119，3株MAb均識(shí)別不同抗原表位。

圖1 PVY-CP蛋白分段表達(dá)示意圖

表2 3株MAb識(shí)別抗原表位分析

“+”：Western blot結(jié)果為陽(yáng)性the western blot result was positive；“-”：Western blot結(jié)果為陰性The western blot result was negative

2.2 PVY快速DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

以常規(guī)DAS-ELISA檢測(cè)方法確定捕獲抗體為9G6，檢測(cè)抗體為HRP-3D3。采用方陣法對(duì)抗體工作濃度進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)捕獲抗體濃度為4 μg·mL-1，檢測(cè)抗體濃度為2 μg·mL-1時(shí)，P/N值最大（表3），檢測(cè)效果最好，故確定其為抗體工作濃度。由P/N值最大可確定捕獲抗體最佳包被條件為4℃過(guò)夜（圖2-A），包被封閉好的酶標(biāo)板即可用于PVY檢測(cè)。

檢測(cè)步驟只需將待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體混合液100 μL/孔加入酶標(biāo)板于37℃進(jìn)行孵育，孵育完成洗滌后加入TMB顯色液，顯色5—10 min后加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。如圖2-B，37℃孵育5 min時(shí)已可對(duì)樣品進(jìn)行定性判斷，孵育15 min時(shí)檢測(cè)效果可達(dá)到最佳。當(dāng)P/N值≥2.1判定陽(yáng)性，1.5≤P/N值＜2.1判定為疑似陽(yáng)性，需進(jìn)一步檢測(cè)，P/N值＜1.5判為陰性結(jié)果。全部檢測(cè)過(guò)程可以在30 min內(nèi)完成。

表3 抗體最佳工作濃度確定

*：P/N值 P/N value

A：捕獲抗體包被條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響The effect of capture antibody incubating condition on the rapid DAS-ELISA；B：待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體混合液孵育條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響The effect of incubation condition of mixture of sample and the detection antibody on the rapid DAS-ELISA

利用優(yōu)化后的快速DAS-ELISA對(duì)PVY馬鈴薯葉片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)葉片稀釋倍數(shù)在10—1 280倍時(shí)，P/N值≥2.1，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（圖3-A），確定該檢測(cè)方法對(duì)PVY馬鈴薯葉片的檢測(cè)范圍為10—1 280倍稀釋。

2.3 檢測(cè)靈敏度分析

運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA，以PVY-CP蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3-B），當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.5 ng·mL-1時(shí)P/N＞2.1，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.1 ng·mL-1時(shí)，P/N值＜2.1，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，故該檢測(cè)方法對(duì)PVY-CP蛋白的檢測(cè)限為0.5 ng·mL-1。

A：PVY馬鈴薯葉片檢測(cè)范圍Detection range of PVY potato leaf；B：PVY蛋白靈敏度曲線Sensitivity curve of PVY protein

2.4 特異性分析

如圖4所示，建立的PVY快速DAS-ELISA檢測(cè)PVY馬鈴薯薯塊及葉片結(jié)果均呈陽(yáng)性，對(duì)PVS、PLRV、PVM馬鈴薯葉片進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，表明檢測(cè)方法特異性良好。

2.5 符合率檢測(cè)

為了對(duì)建立的快速DAS-ELISA符合率進(jìn)行檢驗(yàn)，運(yùn)用快速DAS-ELISA對(duì)田間隨機(jī)采集的50份疑似感染PVY的馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，有33份馬鈴薯樣品檢出PVY，17份樣品未檢出。同時(shí)，將上述所有樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明快速DAS-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到PVY特異性PCR產(chǎn)物，而在17份DAS-ELISA檢測(cè)陰性樣品中，有2份樣品RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，推測(cè)是樣品中PVY的含量低于本檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限。本研究建立的快速DAS-ELISA與RT-PCR共有48份樣品檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)96%。

PVY1：感染PVY的馬鈴薯葉片Potato leaves infected with PVY；PVY2：感染PVY的馬鈴薯種薯Potato seeds infected with PVY；PVS、PLRV、PVM：分別為感染PVS、PLRV、PVM的馬鈴薯葉片Potato leaves infected with PVS, PLRV, PVM, respectively

2.6 馬鈴薯樣品檢測(cè)

如圖5所示，建立的快速DAS-ELISA檢測(cè)方法對(duì)PVYN與PVYO馬鈴薯樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，可滿足田間發(fā)生最為廣泛的株系檢測(cè)需求。

1—6：PVYN馬鈴薯樣品PVYN potato samples；7—12： PVYO馬鈴薯樣品PVYO potato samples

3 討論

PVY所在的馬鈴薯Y病毒屬（）是最大的植物病毒屬之一，該屬基因組包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，表達(dá)時(shí)先編碼一個(gè)多聚蛋白，隨后通過(guò)自身編碼的蛋白酶切割為至少10個(gè)功能不同的成熟蛋白[24-25]，其中高度保守的CP蛋白在病毒侵染過(guò)程中起重要作用，且含有多個(gè)抗原決定簇，決定著病毒的抗原性[26-27]。本研究建立快速DAS-ELISA的基礎(chǔ)是捕獲抗體與檢測(cè)抗體識(shí)別不同的抗原表位，從而避免抗體識(shí)別的表位有重疊甚至重合導(dǎo)致抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原，減弱檢測(cè)信號(hào)、降低檢測(cè)方法靈敏度。目前常用的病毒抗原表位研究方法主要有預(yù)測(cè)法、抗原肽合成法、噬菌體展示法、核磁共振分析法及表面等離子共振技術(shù)等[28]，本研究采用重疊多肽合成法將PVY-CP蛋白分段表達(dá)為有部分重疊的小段蛋白，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合的原理對(duì)抗體識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定。在本研究中使用的3株MAb，雖然皆識(shí)別不同抗原表位，但由于抗體本身的親和力對(duì)抗體的配對(duì)效果也有很大影響，故配對(duì)效果有一定差異。本研究通過(guò)分段表達(dá)PVY-CP蛋白，對(duì)其抗原表位進(jìn)行分析，將MAb識(shí)別的抗原表位確定在30個(gè)氨基酸，篩選出了9G6與3D3兩株識(shí)別不同抗原表位且配對(duì)檢測(cè)效果最佳的MAb，以此為基礎(chǔ)建立了PVY快速DAS-ELISA。

病毒病的發(fā)生和流行是病毒、宿主、環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果。病毒病流行中存在的暴發(fā)性、間歇性和遷移性與病毒生態(tài)系統(tǒng)中各種生物和非生物因素密切相關(guān)，也由于具有“三性”的特點(diǎn)，病毒病的發(fā)生變得頗為復(fù)雜，使得病毒病的流行預(yù)測(cè)困難重重[29-30]。因此，高效快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于有效預(yù)防和控制病毒病至關(guān)重要。DAS- ELISA作為血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的代表性檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于各類檢測(cè)，但受抗體本身的特性影響，DAS-ELISA的檢測(cè)步驟較為固定且檢測(cè)時(shí)間也較長(zhǎng)。BIOREBA出產(chǎn)的DAS-ELISA PVY檢測(cè)試劑盒需至少2 d[31]，秦艷紅建立的PVY DAS-ELISA為確保試驗(yàn)效果檢測(cè)時(shí)間至少需要5 h[32]。本研究建立的PVY快速DAS-ELISA，經(jīng)抗原表位分析后確定的捕獲抗體與檢測(cè)抗體識(shí)別不同的抗原表位，不存在抗原表位競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，直接以待測(cè)樣品研磨液為溶劑稀釋酶標(biāo)檢測(cè)抗體至工作濃度，將抗原抗體混合液直接加入包被封閉好的酶標(biāo)板孵育5 min，顯色5—10 min即可終止，較常規(guī)DAS-ELISA簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，30 min即可完成定性檢測(cè)，檢測(cè)效率顯著提升。

PVY株系分化嚴(yán)重，可分為非重組株系和重組株系。在非重組株系中，發(fā)生較為頻繁的是PVYN和PVYO株系，而在重組株系中，發(fā)生較為頻繁的是PVYN×PVYO類型重組株系[33]。在PVY的研究過(guò)程中，雖然不斷有新的重組株系與非重組株系出現(xiàn)，但在田間實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PVYN×PVYO類型重組株系是田間主流株系，占據(jù)著非常高的比例[34]。鑒于此，本研究使用建立的快速DAS-ELLSIA檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的PVYN和PVYO的馬鈴薯樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示兩株系樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明本研究所建立的檢測(cè)方法盡管以識(shí)別單一位點(diǎn)的單抗為基礎(chǔ)，但仍可滿足田間生產(chǎn)上的檢測(cè)需求。TIAN等[35]對(duì)3株商品化PVY單抗識(shí)別的抗原表位進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)3株商品化單抗表位保守性相對(duì)較好，可檢測(cè)多種PVY株系，這也證明了單克隆抗體可以用于馬鈴薯種質(zhì)監(jiān)測(cè)，滿足生產(chǎn)上的檢測(cè)需求。

4 結(jié)論

以高度保守的PVY-CP蛋白作為檢測(cè)對(duì)象，建立了PVY快速DAS-ELISA，該檢測(cè)方法檢測(cè)限為0.5 ng·mL-1，僅與感染PVY的馬鈴薯樣品反應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，靈敏度高、特異性強(qiáng)。30 min即可完成檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快捷，檢測(cè)效率高，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為試劑盒，為PVY的防控提供技術(shù)及產(chǎn)品支持。

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Mapping of epitopes and establishment of rapid DAS-ELISA for Potato Virus Y Coat Protein

LIANG YuXin1,2, WU JianXiang3, LI XiaoYu2, ZHANG ChunYu2, HOU JiChao1, ZHOU XuePing3,4, WANG YongZhi2,4

1College of Plant Protection, Jilin Agricultural University, Changchun 130118;2Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033;3Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058;4Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】Potato virus Y (PVY) is one of the most serious viruses that affect the yield and quality of potato. At present, no effective virus treatment agent has been found, and application of virus-free seed potato is the main control measure to prevent PVY damage. The objective of this study is to establish a rapid detection method with high sensitivity and specificity, and to provide technical support for quality control of virus-free seed potato.【】PVY coat protein (CP) was expressed as small polypeptides with overlapping parts, and the epitopes of PVY-CP were analyzed by Western blot. Matching experiments were performed on monoclonal antibodies that recognized different epitopes by conventional double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA), and a pair of monoclonal antibodies with the best detection effect was screened. At the same time, the captured and detected antibodies were confirmed. According to the standard of maximum P/N value, the working concentration of antibody was determined by square titration. The optimal co-incubation time of antibody and antigen was determined by control variable method. The sensitivity of rapid DAS-ELISA was tested with different concentrations of PVY-CP protein as antigen. Potato samples infected with different viruses were used as antigens to detect the specificity of rapid DAS-ELISA. Through rapid DAS-ELISA and RT-PCR detection of 50 samples of potato samples with suspected infection PVY collected in the field, the coincidence rate was tested.Finally, the established rapid DAS-ELISA was used to detect potato samples infected by different PVY strains.【】A panel of monoclonal antibodies (9G6 and 3D3) that can be used for DAS-ELISA were screened using the expressed peptides of PVY CP, and a rapid DAS-ELISA was established based on this panel of MAbs. The ELISA plate coated with the capture antibody 9G6, and then co-incubated with detector antibody HRP labeled 3D3 (2 μg·mL-1) and samples for 5 min at 37℃ after blocking the plate. The detection limit was 0.5 ng·mL-1. The results of specific analysis showed that the established method was only positive for potato samples infected with PVY, and negative for potato virus S (PVS), potato virus M (PVM) and potato leaf-roll virus(PLRV). In comparison with RT-PCR, DAS-ELSIA had the coincidence rate of 96% through testing 50 potato simples, and the results of PVYNand PVYOpotato samples were positive. 【】The established PVY detection method has high sensitivity and specificity, and can be completed within 30 min, which is convenient and fast, and provides key technical support for high-throughput detection of PVY and the production of virus-free seed potato.

potato virus Y (PVY); monoclonal antibody; antigen epitope; double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.007

2020-06-11；

2020-08-14

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201604）、吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程人才基金（c92070813）、吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（20180201013NY）

梁雨欣，E-mail：lyx6620@163.com。通信作者王永志，E-mail：yzwang@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）