過量表達(dá)OsRRK1對水稻葉片發(fā)育的影響

馬銀花，莫凱琴，劉璐，李萍芳，金晨鐘，楊芳

過量表達(dá)對水稻葉片發(fā)育的影響

馬銀花1，莫凱琴1，劉璐1，李萍芳1，金晨鐘1，楊芳2

1湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院/湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南婁底 417000；2武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072

【】（rop-interacting receptor-like kinase 1）屬于胞質(zhì)類受體激酶RLCK Ⅵ家族成員，通過對OE-轉(zhuǎn)基因水稻的葉片形態(tài)觀察，明確在水稻葉片發(fā)育中的作用。依據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫公布的目標(biāo)序列設(shè)計引物并構(gòu)建超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到粳稻品種合江19，通過PCR分析鑒定陽性植株，Southern blot鑒定轉(zhuǎn)基因植株插入外源基因的拷貝數(shù)，Northern blot雜交和qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株在RNA水平的表達(dá)情況；選取T2代純合植株抽穗期的劍葉進(jìn)行葉片卷曲指數(shù)（leaf rolling index，LRI）測定；通過石蠟切片和苯胺藍(lán)染色觀察水稻橫切后泡狀細(xì)胞的變化情況，用Image J軟件統(tǒng)計泡狀細(xì)胞的面積；采用葉綠素測定計測量植株葉片葉綠素含量。共獲得OE-轉(zhuǎn)基因陽性植株44株，隨機(jī)選取17株，經(jīng)Southern blot鑒定8株為單拷貝株系，9株為多拷貝株系；隨機(jī)選取2份多拷貝株系（OE-1和OE-4）和5份單拷貝株系（OE-5、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25）用于后續(xù)試驗。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在不同的轉(zhuǎn)基因株系中具有不同程度的過表達(dá)情況，其中OE-1、OE-4和OE-25株系超量表達(dá)程度高，OE-5株系超量表達(dá)程度低，OE-21、OE-22和OE-24株系超量表達(dá)程度居中。從中選取OE-5、OE-22和OE-25共3份單拷貝轉(zhuǎn)基因株系和WT對照經(jīng)Northern blot鑒定后與qRT-PCR結(jié)果一致。統(tǒng)計選取的7個株系和WT對照的葉片卷曲指數(shù)發(fā)現(xiàn)：卷曲程度與表達(dá)量呈正相關(guān)，表達(dá)量越高卷曲程度越高。水稻葉片經(jīng)切片和染色后發(fā)現(xiàn)OE-轉(zhuǎn)基因植株葉片中泡狀細(xì)胞發(fā)生了明顯變化，轉(zhuǎn)基因株系中泡狀細(xì)胞數(shù)目都小于對照中泡狀細(xì)胞均值4.6個。葉片卷曲得越明顯，泡狀細(xì)胞退化得越嚴(yán)重，數(shù)目更少，面積更小。經(jīng)葉綠素含量測定發(fā)現(xiàn)，OE-22、OE-24和OE-25轉(zhuǎn)基因的水稻葉片的葉綠素含量比野生型水稻葉片葉綠素含量高。過量表達(dá)會影響泡狀細(xì)胞的數(shù)目和面積，從而使水稻葉片發(fā)生卷曲，且卷曲程度與表達(dá)量呈正相關(guān)；在水稻中的過量表達(dá)導(dǎo)致葉綠素含量增高。

水稻；；胞質(zhì)類受體激酶；葉片卷曲；葉綠素含量

0 引言

【研究意義】在水稻中，葉片是植物形態(tài)建成的一個重要指標(biāo)，與植物株型的形成密切相關(guān)[1]。葉片形態(tài)的改良，直接或間接的影響到作物光合作用，合適的葉片卷曲導(dǎo)致葉片直立，可提高光合效率，加速干物質(zhì)積累和增加谷物產(chǎn)量，是當(dāng)前水稻高產(chǎn)育種關(guān)注的重點[2-3]。而在水稻生產(chǎn)中，開展葉形基因如何調(diào)節(jié)葉片發(fā)育的研究，對水稻葉形的改良和理想株型的育種具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻葉片是植株進(jìn)行光合作用的主要場所，葉片卷曲是葉片性狀中的一個重要組成部分[4]。水稻卷葉形成的主要因素是葉片中泡狀細(xì)胞的膨脹程度及其滲透壓，生理性逆境（缺水和鹽脅迫等）都會使葉片發(fā)生卷曲，但這種條件下的卷葉性狀是可逆的且不能遺傳，而由基因控制的卷葉性狀一般能夠遺傳且表型穩(wěn)定[2]。在水稻中的卷葉類型可簡單分為3種：正卷、反卷和扭曲，目前已報道了超過35個葉卷曲突變體，且大部分研究表明都與泡狀細(xì)胞生長的狀況與葉片卷曲密切相關(guān)。在已克隆的水稻卷葉基因中，Hu等[5]研究（the narrow and rolled leaf 1）突變以后由于泡狀細(xì)胞數(shù)目變少，葉片發(fā)生正卷，并且葉片也出現(xiàn)變窄現(xiàn)象。Li等[6]研究過表達(dá)（abaxially curled leaf 1）增加泡狀細(xì)胞的數(shù)目導(dǎo)致反卷。Fang等[7]研究發(fā)現(xiàn)（rolling-leaf 14）通過影響葉片次生細(xì)胞壁的形成影響葉片卷曲，突變后引起正卷。Zou等[8]研究發(fā)現(xiàn)（outermost cell-specific gene 5）突變后由于增加泡狀細(xì)胞的數(shù)目和面積導(dǎo)致反卷。Xu等[9]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)可以增加泡狀細(xì)胞的數(shù)目和影響排列導(dǎo)致反卷。Hibara等[10]研究發(fā)現(xiàn)（adaxialized leaf 1）突變以后由于表皮細(xì)胞在近軸面和遠(yuǎn)軸面都變大，并且遠(yuǎn)軸面與泡狀細(xì)胞無法分開而導(dǎo)致葉片反卷。李聰?shù)萚11]發(fā)現(xiàn)了一個新LBD家族基因可以通過調(diào)節(jié)泡狀細(xì)胞，影響水稻葉片卷曲。Fujino等[12]研究突變以后由于泡狀細(xì)胞變小引起葉片卷曲，同時葉片還出現(xiàn)變窄現(xiàn)象。編碼的是一個SHAQKYF家族的轉(zhuǎn)錄因子，屬于KANADI家族，突變以后由于遠(yuǎn)軸面厚壁細(xì)胞的缺失從而導(dǎo)致葉片卷曲，且卷曲程度很高[13]。突變以后也是通過影響泡狀細(xì)胞的形成進(jìn)而調(diào)控葉片卷曲[14]。受體類激酶（receptor-like kinases，RLKs）在植物生長發(fā)育以及生物和非生物的脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[15]，有一類RLKs缺乏細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域，被稱為胞質(zhì)類受體激酶（receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs），RLCKs是一類無胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶，只含有胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，是RLK蛋白激酶超家族中一類特殊的蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)這類蛋白在擬南芥中有200個成員，而在水稻中有379個成員[16]，在水稻中，關(guān)于RLCKs基因的研究很少，僅有、、、、、、等基因被報道，且它們都屬于RLCKⅦ亞家族[17-20]。目前，對RLCKⅥ亞家族的成員的研究還不夠深入，在擬南芥中只有研究了、、和的功能。AtRBK1和AtRBK2可以與Rop GTPase直接互相作用。和參與致病疫霉菌和葡萄孢菌的防御反應(yīng)[21]。和調(diào)節(jié)擬南芥的生長發(fā)育以及防御反應(yīng)[22]。是個多效性基因，并且是水稻類蛋白受體激酶RLCKⅥ家族成員首個被報道的蛋白[23]，進(jìn)一步明確對水稻葉片發(fā)育的影響，可為水稻育種和基因功能的研究提供借鑒?！颈狙芯壳腥朦c】RLCKⅥ家族基因的功能在其他物種中有過報道，但是對水稻中RLCKⅥ家族成員的功能研究鮮有報道。前期研究發(fā)現(xiàn)，作為RLCKⅥ家族成員之一的參與水稻的生長發(fā)育和對褐飛虱的抗性反應(yīng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過構(gòu)建超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化生育期較短易于轉(zhuǎn)化的粳稻品種合江19，得到轉(zhuǎn)基因植株。通過對轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定、葉片形態(tài)觀察、葉綠素含量測定，明確對水稻葉片生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

試驗于2014年9月到2019年10月在武漢大學(xué)雜交水稻國家重點實驗室/湖南人文科技學(xué)院湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心完成。

1.1 供試材料

大腸桿菌（）菌株TOP10和農(nóng)桿菌（）菌株EHA105由武漢大學(xué)雜交水稻國家重點實驗室何光存教授課題組提供；水稻材料粳稻品種合江19（L. subsp.cv. ‘Hejiang 19’）購自國家種質(zhì)資源庫；合江19為一早熟水稻品種，因其生育期短，在本研究中用作水稻轉(zhuǎn)基因研究的受體材料；擴(kuò)增序列用的模板來源于秈稻品種Kasalath（L. subsp.cv. Kasalath）。載體pCXUN由美國Ohio State University王國梁教授提供。

1.2 OsRRK1超量表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫公布的目標(biāo)基因序列，通過Primer5軟件設(shè)計用于基因擴(kuò)增的上下游引物，即OE-OsRRK1-F和OE-OsRRK1-R，提取水稻品種Kasalath的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得目的片段，將擴(kuò)增的DNA片段與用相同的Ⅰ酶消化的pCXUN載體（含有玉米泛素ubiquitin啟動子以及nos終止子）相連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（）菌株TOP10中，通過測序?qū)⑦B接正確的菌株提取質(zhì)粒，即為構(gòu)建成功的過量表達(dá)載體，命名為OE-。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的對粳稻品種合江19的遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建成功的載體提取質(zhì)粒，然后電轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞備用。水稻遺傳轉(zhuǎn)化按照TOKI等[24]方法進(jìn)行，水稻種子經(jīng)過誘導(dǎo)-繼代-前培養(yǎng)→農(nóng)桿菌培養(yǎng)和懸浮→感染和共培養(yǎng)→農(nóng)桿菌去除，之后將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織接種于含50 mg·L-1潮霉素和400 mg·L-1羧芐青霉素的N6培養(yǎng)基上[25]，篩選抗性愈傷組織。在32℃持續(xù)光照培養(yǎng)2周后，將生長旺盛的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含50 mg·L-1潮霉素B和250 mg·L-1羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基上持續(xù)光照誘導(dǎo)芽的分化。2周后將幼苗轉(zhuǎn)移至含50 mg·L-1潮霉素B和200 mg·L-1羧芐青霉素的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根[26]。獲得完整植株后，煉苗7—10 d，移至溫室培養(yǎng)。

1.4 PCR檢測陽性植株

以轉(zhuǎn)基因植株葉片提取的DNA為模板，運用潮霉素基因引物（hyg-L和hyg-R）進(jìn)行檢測，或用載體序列設(shè)計的引物UBIS（F）/UBIA（R）進(jìn)行擴(kuò)增檢測，所用的引物序列如表1所示。

表1 用于構(gòu)建載體的引物

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot分析

利用CTAB法抽提水稻大量基因組DNA，其步驟參考Chen等[27]方法進(jìn)行：DNA限制性內(nèi)切酶消化→凝膠電泳與Southern blot轉(zhuǎn)膜→膜的預(yù)雜交→雜交→探針標(biāo)記→洗膜→壓片→放射自顯影。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析

采用Trizol法提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片的總RNA，參考Chen等[27]方法進(jìn)行：制備MOPS/甲醛變性凝膠進(jìn)行RNA電泳→轉(zhuǎn)膜→膜的預(yù)雜交→雜交→探針標(biāo)記→洗膜→壓片→放射自顯影。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

將轉(zhuǎn)基因植株T2代的純合陽性株系進(jìn)行播種、待長至抽穗期，取水稻劍葉，每個轉(zhuǎn)基因株系取3株。

采用Trizol法提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片的總RNA。RNA的反轉(zhuǎn)錄按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）的操作步驟進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為DNase/RNase-Free ddH2O （TIANGEN）2.9 μL、2×Super mix 4 μL、Primers (5 mmol·L-1) 0.6 μL和cDNA template 0.5 μL。

采用Bio-Rad CFX Manager分析熒光定量PCR分析結(jié)果，首先對其溶解曲線，QC（質(zhì)控）等進(jìn)行分析，去除不達(dá)標(biāo)數(shù)據(jù)，之后用軟件自帶Gene Study功能按（1+E）—tudy算法分析目的基因的表達(dá)。

1.8 葉片卷曲指數(shù)的測定

選取T2代純合植株抽穗期的劍葉進(jìn)行測量，展開葉片，測量其最寬處距離，即為葉片最大寬度（maximum leaf width，Lw）；測量同位置葉片兩邊緣間自然狀態(tài)下距離，即為葉片自然狀態(tài)的寬度（natural leaf width，Ln）。計算出葉片卷曲指數(shù)（leaf rolling index，LRI)，LRI（%）=（Lw-Ln）/Lw×100%；每個轉(zhuǎn)基因的獨立株系隨機(jī)選取20株進(jìn)行測量，重復(fù)3次，取平均值。差異顯著性用檢驗進(jìn)行分析。

1.9 石蠟切片和苯胺藍(lán)染色

在水稻抽穗期時，選取同樣條件下生長于大田中的OE-植株和WT植株的劍葉。取樣位置為正中間最寬處，進(jìn)行材料固定→脫水→透明→滲蠟→包埋→修塊和切片→脫蠟和復(fù)水→染色→鏡檢等基本試驗操作。

1.10 葉綠素含量測定

取新鮮、干凈的野生水稻葉片和過量表達(dá)水稻植株葉片，首先對葉綠素測定計進(jìn)行校準(zhǔn)，之后將葉片置于測定計夾片處，接著2個LED燈源同時發(fā)出紅光和紅外線，2種光穿透葉片打到接收器上，被轉(zhuǎn)換為電信號。通過這兩種波長范圍內(nèi)的透光系數(shù)來確定葉片當(dāng)前葉綠素的相對含量（SPAD值）。隨機(jī)選取20株的劍葉進(jìn)行測量，結(jié)果用20次的數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=20）。差異顯著性用檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 OE-OsRRK1載體的構(gòu)建

以基因組DNA為模板擴(kuò)增含有的ORF序列（圖1-A）。獲得長度為1 179 bp的片段。將其連接至轉(zhuǎn)化載體PCXUN。通過酶切驗證，表明OE-載體構(gòu)建成功（圖1）。

A：OsRRK1全長ORF的擴(kuò)增；B：重組載體的酶切鑒定；C：構(gòu)建成功的OE-OsRRK1載體

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功將OE-載體導(dǎo)入水稻合江19的基因組中。從農(nóng)桿菌侵染的水稻愈傷組織塊中，獲得了抗性愈傷組織塊。將生長旺盛的胚性愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)芽生根，獲得T0代轉(zhuǎn)基因再生植株47株，用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因分子驗證。

2.3 OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

將獲得的OE-植株作為材料，用外源潮霉素設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行初步鑒定（圖2-A），獲得OE-陽性轉(zhuǎn)化植株44株。

從第1代OE-的陽性株系隨機(jī)選出17個進(jìn)行Southern blot分析。利用超霉素引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為探針，通過限制性內(nèi)切酶的消化、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、洗膜和自顯影等過程，確定每個轉(zhuǎn)基因株系中外源基因轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)（圖2-B），其中OE-5、OE-7、OE-16、OE-19、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25為單拷貝株系，其他為多拷貝。為了研究OE-轉(zhuǎn)基因植株中在RNA水平的表達(dá)情況，選取抽穗期的劍葉進(jìn)行取樣提RNA進(jìn)行qRT-PCR分析（圖2-C）。在不同的轉(zhuǎn)基因株系中都出現(xiàn)過量表達(dá)的情況，但過表達(dá)的程度不同，OE-1、OE-4和OE-25株系超量表達(dá)程度高，OE-5株系超量表達(dá)程度很低，OE-21、OE-24和OE-22株系超量表達(dá)程度居中，的表達(dá)程度高低跟拷貝數(shù)沒有直接關(guān)系，多拷貝的株系也不一定就比單拷貝的株系表達(dá)程度高，而幾份單拷貝的株系表達(dá)程度也高低不等。

為進(jìn)一步鑒定OE-轉(zhuǎn)基因植株中的RNA水平表達(dá)情況，選擇抽穗期的劍葉提取RNA，進(jìn)行Northern blot分析，選取OE-5、OE-22和OE-253個單拷貝轉(zhuǎn)基因株系和WT對照。由圖2-D可知，在WT和OE-5中幾乎檢測不到，在OE-22中信號較弱，而在OE-25中信號很強(qiáng)（圖2-D），這與qRT-PCR分析結(jié)果一致。

A：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的PCR檢測；M：MarkerIII；+：陽性質(zhì)粒對照；-：未轉(zhuǎn)基因水稻陰性對照；其余為部分OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因水稻植株。B：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot分析。C：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株的實時熒光定量PCR分析，**在0.01水平的差異顯著性。下同。D：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析。WT：野生型合江19；OE-1—OE-25：部分OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因水稻植株，其中OE-5、OE-7、OE-16、OE-19、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25為單拷貝株系，OE-5：單拷貝表達(dá)量程度低的株系；OE-22：單拷貝表達(dá)量程度中等的株系；OE-25：單拷貝表達(dá)量程度高的株系

2.4 OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株葉片卷曲分析

過表達(dá)的水稻葉片會出現(xiàn)卷曲，選取單拷貝并且表達(dá)程度最高的OE-25作為取樣材料，可見OE-25相對于WT明顯的葉片卷曲（圖3-A）。通過計算葉片的卷曲指數(shù)（圖3-B），可知WT對照的卷曲為0，表達(dá)量程度很低的OE-5也是0，表達(dá)量程度居中的OE-21、OE-24和OE-22株系，葉片卷曲指數(shù)也是居中，表達(dá)量程度高的OE-1、OE-4和OE-25株系葉片卷曲指數(shù)也高，卷曲的程度與的表達(dá)量有關(guān)，表達(dá)量越高卷曲程度越高，與基因的拷貝數(shù)無關(guān)。

A：WT和OE-25植株在抽穗期的劍葉，Bars=5 cm；B：WT和OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株的葉片卷曲指數(shù)

為了分析OE-轉(zhuǎn)基因植株葉片卷曲的原因，選取轉(zhuǎn)基因水稻和對照合江19抽穗期的劍葉進(jìn)行石蠟切片，觀察水稻橫切后各細(xì)胞的變化（圖4-A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OE-轉(zhuǎn)基因植株葉片橫切中不管是中軸、大維管束還是小維管束兩邊的泡狀細(xì)胞數(shù)量減少，面積變小，并且表達(dá)量最高的OE-25的泡狀細(xì)胞退化更明顯，面積最小。為了對泡狀細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行量化，將一片水稻葉片橫切后所有的泡狀細(xì)胞統(tǒng)計，對照中泡狀細(xì)胞數(shù)目均值約為4.6個，而轉(zhuǎn)基因株系中泡狀細(xì)胞數(shù)目都小于4.6，跟對照相比具有極顯著差異，并且表達(dá)程度最高的OE-25株系泡狀細(xì)胞數(shù)量均值只有約3.4個（圖4-B）。同時用Image J軟件對泡狀細(xì)胞的面積進(jìn)行統(tǒng)計，轉(zhuǎn)基因株系與對照相比明顯變小，并且具有極顯著差異（圖4-C）。

2.5 OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株葉片葉綠素含量分析

通過分析OE-轉(zhuǎn)基因植株葉片和WT葉綠素含量的變化（圖5），發(fā)現(xiàn)OE-植株的葉綠素含量要比WT植株的高，具有極顯著性差異。推測過量表達(dá)會導(dǎo)致葉綠素含量增高。

3 討論

轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性的重要因素[28]。本研究構(gòu)建了過量表達(dá)的載體、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)到粳稻品種合江19基因組中，獲得OE-轉(zhuǎn)基因植株。通過Southern blot分析轉(zhuǎn)基因株系外源基因插入的拷貝數(shù)；qRT-PCR和Northern blot分析在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)的表達(dá)程度高低跟拷貝數(shù)沒有直接關(guān)系，多拷貝的株系也不一定就比單拷貝的株系表達(dá)程度高，而幾份單拷貝的株系表達(dá)程度也高低不等。在對高產(chǎn)水稻的理想株型研究中，卷葉性狀的研究被廣泛關(guān)注，因為葉片適度卷曲導(dǎo)致葉片直立不披垂，可提高光合效率，加速干物質(zhì)積累和增加谷物產(chǎn)量[3]，所以適度卷葉是實現(xiàn)水稻育種潛在產(chǎn)量突破的理想性狀。目前，關(guān)于卷葉基因研究中最多的就是通過影響泡狀細(xì)胞的發(fā)育來調(diào)控葉卷的這類基因。本研究中OE-轉(zhuǎn)基因植株與對照相比葉片卷曲明顯，泡狀細(xì)胞數(shù)目更少、面積更小，退化明顯，其他各細(xì)胞無明顯變化，說明過表達(dá)可以通過減少泡狀細(xì)胞的數(shù)目和影響泡狀細(xì)胞面積大小導(dǎo)致水稻葉片正卷，目前這種調(diào)控的具體機(jī)制以及參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還有待進(jìn)一步探究。

A：WT和OE-OsRRK1植株中的劍葉的橫切圖（Bars=100 μm）；紅色箭頭指示泡狀細(xì)胞；B：WT和OE-OsRRK1植株葉片的泡狀細(xì)胞的數(shù)目的統(tǒng)計；C：WT和OE-OsRRK1植株中的劍葉細(xì)胞的面積。WT：野生型合江19；OE-1、OE-4、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株

此外，有研究表明水稻的高產(chǎn)與其生長周期的光合作用密不可分，光合作用是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，作物的干物質(zhì)生產(chǎn)直接來源于光合作用[29-30]。葉綠素是水稻葉片進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)之一，其含量是決定作物光合效率和生物量或產(chǎn)量的重要因素，而葉片葉綠素含量的高低表征水稻光合效率與生長狀況等重要生長指標(biāo)，其與作物產(chǎn)量呈正相關(guān)，因此適量增高葉綠素含量有利于提高產(chǎn)量[31-35]。在OE-轉(zhuǎn)基因植株與野生水稻植株的葉綠素含量分析中發(fā)現(xiàn)3個OE-代表性株系的葉綠素含量均高于野生水稻植株，具有極顯著差異。這表明由于水稻中表達(dá)量增多，使得表達(dá)量升高后可能促進(jìn)了葉片中葉綠素的合成，導(dǎo)致葉綠素含量的增加。

WT：野生型合江19；OE-22、OE-24和OE-25：OE-OsRRK1轉(zhuǎn)基因植株

4 結(jié)論

能夠通過調(diào)控泡狀細(xì)胞的發(fā)育影響OE-轉(zhuǎn)基因植株葉片的卷曲，并且卷曲的程度與的呈正相關(guān)，可通過調(diào)控的表達(dá)量來調(diào)控轉(zhuǎn)基因水稻葉片卷曲程度。

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Effect of Overexpression ofGene on Rice Leaf Development

MA YinHua1, MO KaiQin1, LIU Lu1, LI PingFang1, JIN ChenZhong1, YANG Fang2

1School of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology/Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, Hunan;2College of Life Sciences, Wuhan University/National Key Laboratory of Hybrid Rice, Wuhan 430072

【】(RoP-Interacting receptor-like kinase 1) is a member of the cytoplasmic receptor kinases RLCK VI family. In this study, the leaf morphology of OE-transgenic rice was observed to clarify the role of【】Primers were designed based on target sequences published in the rice genome database to constructoverexpression vector, then transformed to Japonica variety Hejiang 19 mediated by. Positive plants were identified by PCR analysis. The copy number of inserted exogenous genes in transgenic plants was identified by Southern blot hybridization. The expression level of transgenic plants at RNA level was confirmed by Northern blot hybridization and qRT-PCR. T2generation homozygote plants at heading stage was selected to determine the leaf rolling index (LRI). Paraffin sections and aniline blue staining were used to observe the changes of rice bulliform cells after cross-cutting, and Image J software was used to calculate the area of the bubble cells. Chlorophyll content in plant leaves was measured by chlorophyll tester.【】44 positive transgenic plants were obtained and 17 lines were randomly selected for Southern blot analysis. Among the 17 lines, 8 lines were single-copy insertion and 9 lines were multi-copy insertion. 2 multi-copy lines (OE-1 and OE-4) and 5 single-copy lines (OE-5, OE-21, OE-22, OE-24 and OE-25) were randomly selected for subsequent analysis. qRT-PCR analysis revealed thatwas overexpressed with different degree in different transgenic lines. Among them, OE-1, OE-4 and OE-25 lines with the highestexpression level, while OE-5 lines with the lowest and OE-21, 22 and 24 lines with the middle. Three single copy transgenic lines OE-5, OE-22 and OE-25 and WT control were selected for Northern blot analysis. The results were in consistent with the results of qRT-PCR results. Leaf rolling index of the seven selected lines and WT control revealed that the degree of leaf curl was positive correlated with the expression level of, with the higher the expression level, the higher the degree of rolling. Paraffin section and staining revealed the number and area of bulliform cells in the flag leaves of OE-transgenic plants changed obviously compared to WT. OE-transgenic plants showed less bulliform cell number than those in the control whose average is 4.6. OE-transgenic plants with curlier leaf, with the more severe bulliform cell degeneration, less number, smaller area. Chlorophyll content determination revealed that the OE-22, OE-24 and OE-25 lines have higher chlorophyll content than those of the WT rice leaves.【】The overexpression ofaffect the number and size of bulliform cells in rice leaves, which cause leaf rolling, and the degree of leaf rolling is positively correlated with the expression level of. The overexpression ofgene will lead to the increase of chlorophyll content in rice.

;; cytoplasmic receptor-like kinase; leaf rolling; chlorophyll content

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.001

2020-07-16；

2020-08-26

國家自然科學(xué)基金（31800201）、湖南省自然科學(xué)基金青年項目（2019JJ50281）、湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（18B455）、雜交水稻國家重點實驗室（武漢大學(xué)）開放課題基金（KF201901）、婁底市應(yīng)用技術(shù)與開發(fā)項目（33319013）、湖南省應(yīng)用特色學(xué)科（植物保護(hù)）

馬銀花，E-mail：mayinhua1988@126.com。通信作者金晨鐘，E-mail：hnldjcz@sina.com。通信作者楊芳，E-mail：fang-yang@whu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）