基于網絡藥理學探究婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的作用

周珮珮 ，周 霖＃，師瑩瑩，張 俊，左莉華，劉麗偉，李卓倫，張夢雅，李 嘉，孫 志，杜書章*

(1.鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052；2.河南省精準臨床藥學重點實驗室，河南 鄭州 450052）

慢性盆腔炎是一種易發于女性生殖器官內和周圍結締組織及盆腔腹膜的慢性婦科疾病,患者主要表現為下腹部墜痛、月經不調、痛經、白帶增多及腰骶部脹痛等［1-3］。該疾病具有病程較長、病情頑固、易復發發作、遷延難愈等顯著特點,嚴重影響患者的身心健康［4］。目前,臨床上主要依靠抗生素類藥物對慢性盆腔炎進行治療,然而,患者在長時間使用這類藥物后,常易出現肝腎功能損傷、菌群失調以及耐藥等多種不良事件［5-6］。

中醫藥作為中華民族傳統文化的瑰寶,在治療各類疾病方面積累了豐富的經驗,并以其“高效低毒” 的顯著特點,目前廣泛應用于臨床治療過程中。中醫辨證認為慢性盆腔炎主要是由氣滯血瘀、寒凝氣滯、脾虛瘀濁等諸因導致,因此,具有行氣、活血、化瘀作用的藥物將對該疾病具有很好的標本兼治功效［4］。婦可靖膠囊是由丹參、紅花、赤芍、當歸等二十多種藥材配伍而成的中藥復方制劑,該藥中北敗醬、蒲公英、車前子清熱利濕,解毒排膿為君藥,川芎、赤芍、三七、紅花、丹參活血化瘀；延胡索疏肝理氣,止疼痛為臣藥；白術、茯苓益氣健脾,補氣生血,鱉甲、地骨皮滋補陰液,涼血除蒸,當歸、熟地黃養血調經,白芍滋陰柔肝,共為佐藥。馬齒莧、柴胡為臣藥。諸藥合用,共奏清熱利濕,化瘀散結,行氣止痛,調補氣血之功,對于淤毒內結、氣滯血瘀所致的慢性盆腔炎具有很好的針對性治療作用。同時,中藥及其復方制劑具有多成分、多靶點、多途徑等協同作用效果,使得依靠傳統的“單成分、單靶點” 研究思路已經很難對其進行較為整體、系統的作用機制研究［7-8］。隨著各種組學理論、高通量篩選、分析技術的發展以及計算方法的不斷進步,網絡藥理學以其系統生物學、多向藥理學為理論基礎的研究策略與傳統中醫癥候的理念具有異曲同工之妙,體現了生物平衡的理念,特別適用于中藥的復雜作用機制研究［9］。

課題組擬借助網絡藥理學的研究思路,從系統生物整體的角度去深入探討婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的潛在活性成分及作用機制,為進一步的藥效物質基礎和作用機制以及靶向新藥研發提供重要的參考依據。

1 資料與方法

1.1 主要網絡數據庫及軟件 TCMSP 數據庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Therapeutic Target Database數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、OMIM 數據庫 (http://www.omim.org/)、DAVID (http://bioinfo.Capitalbio.com/mas3/)、Cytoscape 3.6.1 軟件。

1.2 活性成分及靶點篩選 通過檢索中藥藥理學分析平臺(TCMSP),并以婦可靖膠囊的20 余味藥材組成“北敗醬、車前子、蒲公英、香附(醋制)、赤芍、紅花、丹參、延胡索、三七、秦艽、地骨皮、鱉甲、海藻、黨參、白術(炒)、茯苓、熟地、當歸、馬齒莧、柴胡” 等為關鍵詞檢索其藥物活性成分及相關靶點。中藥活性成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB) 主要反映其化合物的吸收程度；類藥性(Drug Likeness,DL) 是化合物與已知藥物的類似性,OB 和DL 值是中藥能夠吸收入血并分布至靶器官發揮藥效作用的兩大關鍵指標。本研究首先采用TCMSP 數據庫查詢每個藥物活性成分的OB 和DL 值,設定其化學成分須同時滿足OB≥35% 且DL≥0.25,初步篩選出候選成分,通過活性成分-靶點網絡degree 值進一步篩選活性成分。

1.3 活性成分-靶點網絡構建 由于藥物成分對應的靶點可能存在命名不規范或不統一的問題,因而首先通過UniProt 數據庫(http://www.uniprot.org/uploadlists/) 轉換候選成分對應的靶點基因名,再將化合物及對應的靶基因數據導入Cytoscape 3.6.1 軟件,構建婦可靖膠囊的活性成分-靶點網絡圖。其中,度值(degree) 反映所構建網絡中某一節點與其它節點的總連接數目；介數是指網絡中所有最短路徑中經過某節點的路徑數目與最短路徑總數的比值,度值和介數是體現某節點在網絡中重要性的關鍵拓撲參數。

1.4 慢性盆腔炎相關疾病靶點篩選 本研究通過藥物靶標數據庫(Therapeutic Target Database,TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp) 和孟德爾遺傳數據庫 (Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org/) 數據庫檢索慢性盆腔炎相關靶點,然后將篩選得到的藥物靶點信息和慢性盤腔炎疾病靶點信息進行對比分析。

1.5 婦可靖治療慢性盆腔炎的關鍵靶點篩選 根據篩選得到的藥物成分靶點和疾病靶點信息,采用Cystoscope 3.6.1軟件構建蛋白互作網絡(protein protein interaction,PPI),取其交集,運用Network Analysis 對網絡進行拓撲結構分析。在分析得到的拓撲網絡結構信息中,選擇連接度(degree) 大于2 倍以上中位數值的節點作為關鍵候選靶點并生成網絡。再分析該網絡并得到新的拓撲網絡信息,計算每個節點的“連接度” “接近中心性(Closeness Centrality,CC) ” “中介中心度(Betweenness Centrality,BC) ” “鄰域連通性(Neighborhood Connectivity,NC) ” 4 個拓撲結構特征值并進行二次篩選,最終選擇以上四者特征值均大于其相應中位數的節點作為其關鍵靶點。

1.6 KEGG 信號通路及GO 生物過程富集分析 將得到的婦可靖治療慢性盆腔炎的關鍵潛在靶點在人類基因組注釋數據庫DAVID 6.8 (http://david.ncifcrf.gov/) 進行KEGG 通路注釋分析和GO 富集分析,以P＜0.05 為標準進行篩選。由此,關鍵靶點(基因) 可直接映射到通路上,這些富集得到的通路即是藥物發揮治療疾病并起調節作用的關鍵途徑,通過該方法可得到婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的代謝通路及相關生物學過程等相關信息。

1.7 婦可靖膠囊“活性成分-靶點-通路” 網絡模型圖構建 將婦可靖膠囊中的活性成分、對應預測靶點和通路分析結果,分別構建“活性成分-靶點”、“靶點-通路” 之間的相互關系,將其導入Cytoscape 軟件中構建婦可靖膠囊相關“活性成分-靶點-通路” 網絡模型圖。

2 結果

2.1 主要活性成分信息與活性成分-靶點網絡 本研究經設定的OB 及DL 進行篩選后,共得到91 個具有良好的口服吸收利用度和類藥性的藥物活性成分,見表1。通過TCMSP 數據庫預測91 個藥物成分作用靶點,在TCMSP 數據庫里根據OB 和DL 值篩選并采用uniprot 數據庫改正藥物名稱為其規范名稱,刪除沒有規范名稱與重復后共得到154個潛在靶點,同時構建婦可靖膠囊的主要活性成分-靶點網絡圖,如圖1 所示。分析網絡圖可知,其中21 個成分作用靶點頻率大于33,通過頻率發現,婦可靖的活性成分與PTGS、MAPK、NOS 等炎癥靶點群相關,如表2 所示。

表1 基于TCMSP 篩選的婦可靖膠囊潛在活性成分

續表1

表2 婦可靖膠囊91 種成分的潛在作用靶點（頻數≥33 次）

2.2 婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的關鍵靶點篩選 本研究基于多個數據庫及挖掘文獻數據,共搜到慢性盆腔炎相關靶點203 個。將203 個疾病相關靶點與在TCMSP 數據庫中得到的成分靶點進行比對分析,共得到28 個婦可靖治療慢性盆腔炎的潛在作用靶點,見表3。

表3 婦可靖膠囊治療盆腔炎的潛在作用靶點

圖1 婦可靖膠囊主要活性成分-靶點網絡圖

為了進一步揭示治療盆腔炎炎癥作用靶點的潛在機制,采用Cytoscape 3.6.1 軟件構建有效活性成分靶點的PPI 及疾病靶點的PPI,結果發現共有5 260 個成分預測靶點及7 496個慢性盆腔炎疾病靶點具有蛋白-蛋白相互作用(其中包括4 118 個重疊靶點),表明78.29% 的成分靶點和54.94%的疾病靶點具有直接或間接的相互作用。取藥物成分及疾病靶點的蛋白質互作網絡交集靶點,然后分析每個點的拓撲結構特征值,得出其“連接度” 中位數值為33,因此,第一次選擇“degree≥66” 的節點作為候選靶點(2倍以上中位數),共得到1 025 個靶點。接著對候選靶點的信息再次進行提取分析,并以“連接度” “接近中心性”“中介中心度” “鄰域連通性” 大于其相應中位數為第二次篩選條件進一步選擇合適的節點,即degree≥72,CC≥0.51,BC≥3.7×10-4,NC≥124.46,最終得到婦可靖治療慢性盆腔炎的關鍵靶點797 個,見圖2。

圖2 婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的關鍵靶點篩選

2.3 核心靶點的KEGG 信號通路及GO 生物過程富集分析

2.3.1 KEGG 通路富集分析 將篩選到的核心靶蛋白導入DAVID 數據庫進行KEGG 富集分析,條件設置為P＜0.05且FDR＜0.05 (錯誤發現率),剔除不相關通路后,共得到重要通路8 條,分別為腫瘤壞死因子信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、NF-κ B 信號通路、白細胞經內皮遷移及MAPK 信號通路等,結果見表4。由此可知,與婦可靖治療慢性盆腔炎相關性最大的通路是MAPK 信號通路,將相關靶點經過通路富集分析后,映射在該通路上的靶點數最多,P值顯著。TNF 信號通路與慢性盆腔炎的發生關系密切,從代謝通路結果顯示可推斷婦可靖膠囊可能主要通過干預NOD 樣受體主介導下游MAPK 與NF-κB 蛋白靶點激活TNF 通路,調節TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子,并降低其表達水平,抑制子宮內膜炎癥細胞增生,起到治療炎癥疾病的作用。

表4 經KEGG 富集分析后的主要通路

2.3.2 GO 生物過程富集分析 將篩選得到的核心靶蛋白導入DAVID 數據庫進行GO 生物學過程富集分析,即分別從生物過程、細胞組分及分子功能3 個層面對基因功能進行注釋。GO 富集分析結果顯示,婦可靖治療慢性盆腔炎的靶基因主要富集在138 個生物學過程,56 種細胞組分和54種分子功能。按照重要性由高到低進行排序,主要生物學過程富集結果見圖3,細胞組分及分子功能富集分別見圖4～5。由此可見,藥物治療疾病的生物過程主要涉及基因、蛋白及核糖體等小分子代謝過程的調節,這些靶點在細胞組分中與胞核、胞質以及胞膜等相關性最大,在分子功能中與ATP 等能量結合、DNA 等基因結合及蛋白質結合等相關性最大。

圖3 GO 富集分析的生物過程

圖4 GO 富集分析的細胞組分

圖5 GO 富集分析的分子功能

2.4 婦可靖膠囊“成分-靶點-通路” 網絡模型構建 采用Cytoscape 軟件構建婦可靖膠囊“活性成分-靶點-通路” 網絡模型,見圖6,其作用靶點分布于不同的代謝通路,相互協調,相互關聯,從多種途徑體現藥物治療盆腔炎的作用機制。

3 討論

本研究基于網絡藥理學對中藥復方進行深入研究,通過“活性成分-靶點預測-疾病” 關系網絡的構建、拓撲參數的分析及生物信息的挖掘對婦可靖膠囊治療女性盆腔炎在整體分子水平上闡述作用機制,打破“一個藥物一個靶標” 的傳統研究理念,為臨床上研究中藥多成分、多靶點、多通路提供重要的借鑒思路［10-11］。通過設置篩選條件后共得到婦可靖膠囊的主要活性成分91 種,作用靶點共154 個,通過網絡拓撲分析得到其治療慢性盆腔炎的關鍵核心靶點797 個。KEGG 分析顯示藥物作用靶點主要富集于MAPK、TNF、NOD 樣受體,Toll 樣受體以及T 細胞受體信號通路等關鍵途徑,尤以NOD/ NF-κB/TNF 通路密切相關。NOD 樣受體是表達于固有免疫細胞表面的一種受體蛋白,其介導的炎癥信號通路在機體抗感染免疫應答中具有重要作用。NOD 樣受體主要通過介導NF-κB 通路、MAPK 通路和自噬通路參與抗細菌免疫應答,在胞外刺激物的誘導下,能調控相關促炎基因如IL-1β 和TNF-α 的轉錄和表達,導致其大量產生,引發一序列的炎癥損傷［12-13］；淋巴細胞是構成機體免疫系統的主要細胞群,T 細胞可分化為具有不同生物學功能的細胞亞群以協助協助和動員其它免疫細胞一起清除體內入侵的病原體。婦可靖膠囊可能主要通過干預NOD 樣受體主介導下游MAPK 與NF-κB 蛋白靶點激活TNF通路,調節TNF-α、IL-1β、IL-6 等一系列炎性因子,抑制子宮內膜炎癥細胞增生,起到治療慢性盆腔炎的作用。

圖6 婦可靖膠囊“成分-靶點-通路” 網絡圖

婦可靖膠囊潛在作用靶點前列腺素-內環氧合酶(PTGS),是前列腺素合成的關鍵酶,同時為非甾體抗炎藥物作用靶點；MMP9 與血管內皮生長因子的產生關系密切,MMP2 能夠裂解各種膠原蛋白及黏連蛋白,靶點基因體現了婦可靖膠囊“逐瘀清化” 的特點［14］；CCL2 屬于趨化因子,一類同時參與免疫調節和炎癥過程的分泌蛋白家族。這體現了婦可靖膠囊治療盆腔炎“清熱解毒” 的藥物特點［15］。本研究結果顯示,KEGG 富集分析得出的婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎通路與靶點與免疫炎癥高度相關,這與化學成分研究結果相吻合。

慢性盆腔炎的發病機制與病理因素極其復雜,而傳統的“單成分-單靶點-單疾病” 模式并不適合中藥復方制劑研究。網絡藥理學基于“藥物靶點網絡-疾病基因網絡-蛋白蛋白互作網絡” 從整體水平上探索并闡釋藥物治療疾病的復雜作用機制,可以更加直觀地理解婦可靖膠囊和慢性盆腔炎的相互作用。本研究基于網絡藥理學理念,構建“成分-靶點-疾病” 網絡,初步分析婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的藥效物質基礎及可能的作用機制,為下一步更深入地分子機制驗證及研究奠定了扎實可靠的前期基礎。