Aurora A 激酶抑制劑Alisertib 誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的作用及與p53表達(dá)間的關(guān)系

任寶軍，劇永樂(lè)，封靜，陳淑香，劉家旋，羅振濤，王家智，楊帆，李德智，董博業(yè)，耿巖*

在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌（CRC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第三位，死亡率居第二位［1］，尤其晚期結(jié)直腸癌的治療效果不佳，仍缺乏有效的靶向藥物。Alisertib 是第二代Aurora A 激酶（AURKA）抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤具有抑制細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞周期發(fā)展的作用［2-4］。但Alisertib對(duì)CRC 的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用尚不清楚。p53 是一種抑癌基因，在CRC 的腫瘤形成機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其與Alisertib 的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用的關(guān)系值得研究。本研究應(yīng)用Caco-2 和HT29 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討ALS 對(duì)不同p53 表達(dá)狀態(tài)的CRC 細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Alisertib、SB202190（選擇性p38 MAPK 抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑）購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；Cyto-ID?自噬檢測(cè)試劑盒及膜聯(lián)蛋白V：藻紅蛋白（PE）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Enzo Life Sciences 公司；p53、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、p-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、p38 MAPK、p-Akt（Ser473）、Akt、LC3-I/II、Western Blotting 底物購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。凝膠成像系統(tǒng)4000R PRO（美國(guó)Kodak 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2 和HT29 細(xì)胞來(lái)自美國(guó)ATCC。用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃及95%空氣的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬率、凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 和HT29 細(xì)胞按密度3×105及6×105個(gè)/培養(yǎng)皿接種于60 mm 培養(yǎng)皿，24 h后用 0.1、1、5 μmol/L Alisertib 處理細(xì)胞，或先用10 μmol/L SB202190 處理細(xì)胞，1 h 后再用 5 μmol/L Alisertib處理細(xì)胞。對(duì)照組為同濃度的二甲基亞砜（DMSO）。作用24 h 后按照Cyto-ID?自噬檢測(cè)試劑盒或膜聯(lián)蛋白V：藻紅蛋白（PE）凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬率、凋亡率。

1.4 Western Blotting 法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 和HT29 細(xì)胞按密度3×105及6×105個(gè)/培養(yǎng)皿接種于60 mm 培養(yǎng)皿，24 h后用0.1、1、5 μmol/L Alisertib 處理細(xì)胞，作用 48 h后按照Western Blotting 試劑盒說(shuō)明書處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以β-actin 作為內(nèi)參，應(yīng)用Image Lab 軟件對(duì)Wester Blotting 條帶進(jìn)行灰度值測(cè)量，測(cè)算各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。余數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。多重比較應(yīng)用Prism 軟件通過(guò)單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Tukey 的多重比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Alisertib 誘導(dǎo)了 Caco-2 和 HT29 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬

對(duì)照組Caco-2 細(xì)胞自噬率為8.1%，實(shí)驗(yàn)組0.1 μmol/L Alisertib組和1 μmol/L Alisertib組細(xì)胞自噬率增加，分別為26.4%和26.8%（P＜0.01，圖1）。對(duì)照組HT29 細(xì)胞自噬率為7.3%，實(shí)驗(yàn)組1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib組細(xì)胞自噬率增加，分別為36.8%和42.6%（P＜0.01，圖1）。

圖1 ALS 誘導(dǎo)Caco-2 和HT29 細(xì)胞發(fā)生自噬 將Caco-2 和HT29 細(xì)胞暴露于0.1、1 和5 μmol/L ALS 24 h，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞斑點(diǎn)圖顯示通過(guò)Cyto-ID 染色的發(fā)生自噬的Caco-2 和HT29 細(xì)胞

2.2 Alisertib 調(diào)節(jié) Caco-2 和 HT29 細(xì)胞中的 PI3K/Akt 和 p38 MAPK 信號(hào)通路

與對(duì)照組比較，1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組 Caco-2 細(xì)胞的 p-PI3K/PI3K 的比值分別降低為對(duì)照組的62.6%和45.2%；0.1 μmol/L Alisertib組、1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組Caco-2 細(xì)胞p-Akt/Akt 的比值分別降低為對(duì)照組的50.4%、30.1%和38.2%（P＜0.01，圖2）；1 μmol/L Alisertib組和 5 μmol/L Alisertib 組 Caco-2 細(xì)胞的 p-p38/p38的比值分別降低為對(duì)照組的49.0%和30.4%（圖2）。并且0.1 μmol/L ALS組、1 μmol/L ALS組和5 μmol/L ALS 組 Caco-2 細(xì)胞 LC3-Ⅱ/LC3-I 的比值較對(duì)照組分別升高67.3%、32.6%和46.8%（P＜0.01，圖2）。

在Caco-2 細(xì)胞中p53 蛋白表達(dá)缺失（圖3）。而在 HT29 細(xì)胞中，1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組p53 蛋白的表達(dá)水平升高為對(duì)照組的1.4 倍和1.5 倍（P＜0.05，圖3）。

與對(duì)照組比較，1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組HT29細(xì)胞的p-PI3K/PI3K的比值分別降低為對(duì)照組的70.9%和66.3%（P＜0.001，圖3）；0.1 μmol/L Alisertib 組、1 μmol/L Alisertib 組和5 μmol/L Alisertib 組 HT29 細(xì)胞的 p-Akt/Akt 的比值分別降低為對(duì)照組的81.4%、85.2%和27.2%（P＜0.01，圖3）；0.1 μmol/L Alisertib組、1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組 HT29 細(xì)胞的 p-p38/p38 的比值較對(duì)照組分別升高62.7%、2.1 倍和2.0 倍（P＜0.05，圖3）；1 μmol/L ALS 組和 5 μmol/L ALS 組 HT29 細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-I 的比值較對(duì)照組分別升高78.5%和84.8%（P＜0.01，圖3）。

圖2 ALS 對(duì)Caco-2 細(xì)胞中自噬通路上關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白分子的表達(dá)水平的影響 ALS 處理Caco-2 細(xì)胞后通過(guò)Western Blotting 法測(cè)定 PI3K、Akt、p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平，以及LC3-I 和LC3-II 的蛋白表達(dá)水平，上圖為蛋白表達(dá)的代表性印跡條帶

圖3 ALS 對(duì)HT29 細(xì)胞中自噬通路上關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白分子的表達(dá)水平的影響 ALS 處理HT29 細(xì)胞后通過(guò)Western Blotting 法測(cè)定 PI3K、Akt、p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平，以及LC3-I 和LC3-II 的蛋白表達(dá)水平，上圖為蛋白表達(dá)的代表性印跡條帶

2.3 在HT29 和Caco-2 細(xì)胞中Alisertib 誘導(dǎo)的凋亡和自噬之間存在交互影響

在HT29和Caco-2細(xì)胞中，與5 μmol/L Alisertib組比較，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib 組細(xì)胞自噬率升高，分別較5 μmol/L Alisertib 組細(xì)胞自噬率升高88.8%和86.6%（P＜0.001）。

在 HT29 細(xì)胞中，與 5 μmol/L Alisertib 組比較，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib 組細(xì)胞凋亡率升高64.7%（P＜0.001）。而在Caco-2 細(xì)胞中，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib組較5 μmol/L Alisertib 組的細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。

3 討 論

結(jié)直腸癌現(xiàn)有的治療措施包括外科手術(shù)、放療、化療等，但晚期結(jié)直腸癌患者總體治療效果較差，亟需新的精準(zhǔn)的靶向藥物治療。Alisertib（ALS）是選擇性抑制Aurora A 激酶的小分子藥物，對(duì)前列腺癌等實(shí)體瘤、白血病有很強(qiáng)的抗癌作用［5，6］。ALS是否引起CRC細(xì)胞自噬性死亡值得進(jìn)一步研究。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的分解代謝的過(guò)程。損壞的、功能失調(diào)的或過(guò)剩的細(xì)胞器和蛋白被吞噬、重利用以維持細(xì)胞正常的代謝、生存和內(nèi)穩(wěn)定［7］。過(guò)度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在某些條件下，自噬通過(guò)增加程序性細(xì)胞死亡來(lái)抑制腫瘤形成［8］。有多個(gè)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，包括正向調(diào)節(jié)通路（PI3K/Akt 和p38 MAPK 信號(hào)通路），發(fā)揮抑制自噬的作用，以及負(fù)向調(diào)節(jié)通路（AMPK 和p53 信號(hào)通路），發(fā)揮促進(jìn)自噬的作用［9-11］。

本研究顯示實(shí)驗(yàn)組0.1 μmol/L Alisertib 組和1 μmol/L Alisertib 組較對(duì)照組Caco-2細(xì)胞自噬率增加，分別為26.4%和26.8%，同樣地，實(shí)驗(yàn)組1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組較對(duì)照組 HT29細(xì)胞自噬率增加，分別為36.8%和42.6%。提示ALS誘導(dǎo)了Caco-2 和HT29 細(xì)胞發(fā)生自噬。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞自噬通路上的關(guān)鍵蛋白分子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在分子水平ALS 引起Caco-2 和HT29 和細(xì)胞的 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值明顯降低，LC3-II/LC3-I 的比值明顯升高。這些結(jié)果表明引起自噬的潛在分子學(xué)機(jī)制可能為對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)的抑制。有趣的是，ALS 對(duì)p38 MAPK 信號(hào)通路的修飾作用有所不同，引起Caco-2 的p-p38/p38 的比值下降，而HT29 的p-p38/p38 比值升高。這一現(xiàn)象可能與p38 MAPK 有四個(gè)不同的亞型有關(guān)，包括p38 α、p38 β、p38γ和p38δ。研究顯示在哺乳動(dòng)物中，其上游調(diào)節(jié)因子及下游靶點(diǎn)隨著細(xì)胞類型及刺激因子的不同而不同［12］。此外，HT29 細(xì)胞的p53 基因沒(méi)有突變，而Caco-2 細(xì)胞的p53 基因有突變，并且不能表達(dá)p53 蛋白。這些特征可能引起兩個(gè)細(xì)胞系的p38 MAPK 信號(hào)通路產(chǎn)生不同的變化。其他研究顯示，在胃癌細(xì)胞［13］、胰腺癌細(xì)胞［3］、骨肉瘤細(xì)胞［14］、乳腺癌細(xì)胞［15］和卵巢癌細(xì)胞［4］中Alisertib 可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR、p38 MAPK或Erk1/2 信號(hào)通路而激活A(yù)MPK 信號(hào)通路促進(jìn)了細(xì)胞自噬。

細(xì)胞自噬和凋亡均是高度保守和嚴(yán)密調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程，通常這兩個(gè)生物學(xué)過(guò)程包含相似的調(diào)節(jié)通路，甚至共享相同的啟動(dòng)子和效應(yīng)子。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬和凋亡的交互作用可協(xié)同影響以使細(xì)胞選擇二者中的某一途徑，決定細(xì)胞的命運(yùn)，以達(dá)到內(nèi)部平衡。我們的研究通過(guò)應(yīng)用SB202190（選擇性p38 MAPK 抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑）進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明自噬誘導(dǎo)劑SB202190 在Caco-2 和HT29 細(xì)胞中均增強(qiáng)了Alisertib 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，但在HT29 細(xì)胞中明顯增強(qiáng)了Alisertib 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在Caco-2 細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。這些對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡的差異效應(yīng)可能取決于細(xì)胞類型的差異。由此可以推測(cè)，某些重要的調(diào)節(jié)分子和信號(hào)通路協(xié)同介導(dǎo)了這一復(fù)雜的凋亡和自噬之間的交互作用，包括PI3K/Akt、p38 MAPK 信號(hào)通路及p53 是否表達(dá)。

綜上所述，Alisertib 誘導(dǎo)了 Caco-2 和 HT29 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。此過(guò)程涉及了多個(gè)信號(hào)通路的參與，包括 PI3K/Akt、p38 MAPK 信號(hào)通路，并可能與p53 蛋白是否表達(dá)有關(guān)。Alisertib 可能代表了一類新的有潛力的治療CRC 的靶向藥物。