TRIM11 對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

王兆豐，許曉波，唐文瀟，朱有才，胡繼超，張新根

骨肉瘤是一種侵襲性的原始骨間充質腫瘤[1]。近年來盡管預后有所改善，但轉移性或復發性骨肉瘤的臨床治療仍然具有挑戰性，在過去的三十年里，治療基本上沒有改變[2]。目前的治療方法主要包括手術切除和全身化療（如阿霉素和順鉑）。然而，患者很快就會產生耐藥性并復發。據報道，藥物流入/流出蛋白的過度表達、DNA修復的增強和致癌信號轉導通路的激活是骨肉瘤化療耐藥的原因[3]。因此，通過研究特異性致癌信號通路和致癌基因改善骨肉瘤的治療與預后受到了廣泛的關注。TRIM11 是TRIM家族的重要成員之一，研究表明TRIM家族的多個成員可通過Wnt/ -catenin、IFN、p53 等信號通路直接參與腫瘤的調控[4-5]。本研究旨在探討TRIM11 基因對骨肉瘤細胞增殖與凋亡的影響，為骨肉瘤的治療與預后提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 人骨肉瘤細胞株MG63、HOS、U2OS、Saos-2、143B 購自上海細胞庫；TRIM11-SiRNA 骨肉瘤細胞株Saos-2 購自源井生物科技公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養基、青鏈霉素購自Solarbio 公司；TRIM11 一抗、GAPDH 一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購自Proteintech 公司；Q-PCR試劑盒、ECL發光液、RIPA蛋白裂解液、CCK8 試劑盒購自上海碧云天公司；流式細胞儀、實時熒光定量PCR 儀、化學發光凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；超凈工作臺、大小型高速冷凍離心機購自常州諾基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養液培養成骨細胞和骨肉瘤細胞MG63、HOS、U2OS、Saos-2及143B。置于37℃5%CO2飽和濕度下對細胞進行培養，0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 分析TRIM11 在骨肉瘤細胞和正常成骨細胞中的表達 取骨肉瘤細胞及正常成骨細胞，按照RNA提取試劑盒說明書要求操作提取各細胞RNA定量，逆轉錄合成cDNA，按照q-PCR 試劑盒說明書操作進行檢測TRIM11 基因的表達。采用RIPA 提取各組細胞蛋白，采用BCA 法蛋白定量后，取蛋白樣品15 g進行電泳，轉膜、封閉、加入TRIM11 抗體孵育。洗滌之后加入辣根過氧化酶標記的二抗，孵育，洗滌后用ECL 化學發光試劑反應，曝光后掃描。

1.2.3 基因芯片數據集信息分析 通過GEO（編號E-MEXP-3628）數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載高通量數據集GSE16102 和GSE39055 分析TRIM11 基因高表達與骨肉瘤患者預后不良的關系。

1.2.4 細胞株篩選 取對數增長期的五種骨肉瘤細胞，采用Q-PCR 和Western blot檢測（操作步驟同1.2.2）五種細胞株中TRIM11 基因和蛋白的表達。

1.2.5 CCK8 實驗 細胞分組正常骨肉瘤細胞Saos-2、SiRNA-NC 骨肉瘤細胞Saos-2、Trim11-SiRNA 骨肉瘤細胞Saos-2，按照CCK8 試劑盒說明書要求檢測3 組細胞0、12、24、48 及72h 的細胞增殖情況，采用流式細胞儀檢測三組細胞的凋亡情況。

1.2.6 基因集富集分析 采用GSEA 2.2.1 版本軟件對E-MEXP-3628 數據庫中的骨肉瘤表達譜芯片GSE16102 和GSE39055數據集進行分析，參照基因集由GSEA 網站MisgDB 數據庫中的生物信號傳導相關的基因集，利用缺省加權富集統計的方法進行富集分析，設置隨機組合次數1 000 次。

1.3 統計方法 采用Graph Pad Prism6.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM11 基因和蛋白在骨肉瘤細胞和正常骨成骨細胞中的表達 相對于正常成骨細胞，骨肉瘤細胞中TRIM11 的基因和蛋白明顯上調（均＜0.05）。見封二彩圖2。

圖2 TRIM11 基因和蛋白在骨肉瘤細胞和正常骨細胞的表達

2.2 TRIM11 基因高表達與骨肉瘤患者預后不良的關系 相對于正常組，骨肉瘤組TRIM11 基因表達明顯上調（＜0.05）；TRIM11 表達上調與骨肉瘤患者預后不良呈正相關（＜0.05）。見封二彩圖3～4。

圖3 TRIM11 基因在骨肉瘤和正常組織中的表達

圖4 TRIM11 高表達與預后不良的影響

2.3 TRIM11 在5 種骨肉瘤細胞株的表達情況 相對于其他細胞株，HOS 細胞株中TRIM11 基因與蛋白表達量最低，而Saos-2 細胞株中TRIM11 表達量較高。因此本研究選擇Saos-2 細胞株作為目標骨肉瘤細胞株開展細胞功能試驗。見封二彩圖5。

圖5 A：TRIM11 基因在五種骨肉瘤細胞中的表達；B：TRIM11 蛋白在五種骨肉瘤細胞中的表達

2.4 TRIM11基因干擾后對Saos-2細胞增殖和凋亡的影響 相對于對照組，NC組細胞增殖活性無明顯變化（＞0.05）；與NC 組比較，Trim11-SiRNA 細胞增殖活性明顯降低（＜0.05）。與對照組比較，NC 組細胞凋亡情況無明顯變化（＞0.05）；與NC 組比較，Trim11-SiRNA細胞凋亡明顯增多（＜0.05）。見封二彩圖6 ～7。

圖6 TRIM11 基因干擾后對骨肉瘤細胞Saos-2 增殖的影響

圖7 TRIM11 基因干擾后對Saos-2 細胞凋亡的影響

2.5 TRIM11 基因表達對Cell cycle 和MAPK 信號通路的影響 骨肉瘤中TRIM11 基因表達上調會激活Cell cycle和MAPK 信號通路，骨肉瘤中TRIM11基因表達下調會抑制 Cell cycle 和MAPK 信號通路。見封三彩圖1 ～2。

圖1 骨肉瘤中TRIM11 基因表達對Cell cycle 信號通路的影響

圖2 骨肉瘤中TRIM11 基因表達對MAPK 信號通路的影響

3 討論

目前針對骨肉瘤的治療主要以手術聯合化療為主，雖然該策略使骨肉瘤患者預后得到改善，但依然大量患者出現復發轉移、化療耐藥等問題。因此對致癌基因和致癌信號通路的研究，對骨肉瘤患者的治療與預后具有重要意義。

近年來，越來越多的研究表明TRIM基因在人類癌癥發生與發展中具有重要作用。本研究以TRIM11 為研究基因，觀察TRIM11 的表達對骨肉瘤增殖和凋亡的影響。結果顯示相對于正常成骨細胞，骨肉瘤細胞TRIM11 基因和蛋白的表達明顯上調，且TRIM11 基因與骨肉瘤預后不良呈正相關。通過構建TRIM11-SiRNA 骨肉瘤細胞株Saos-2，觀察TRIM11 基因干擾后對骨肉瘤細胞Saos-2 增殖和凋亡的影響，結果發現下調TRIM11 表達可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，而TRIM11 過表達則起到相反的作用。以上結果說明，TRIM11 可能是骨肉瘤中的癌基因，通過促進細胞增殖和細胞周期發揮作用。研究證明，Cell cycle 和MAPK 信號通路的激活在骨肉瘤的發生發展中具有重要作用[6-7]，通過基因富集分析，發現在骨肉瘤中TRIM11 基因表達上調會激活Cell cycle和MAPK 信號通路，而TRIM11 表達下調則相反，這說明了TRIM11 表達上調激活Cell cycle 和MAPK 信號通路可能是骨肉瘤發生發展的潛在機制。

綜上所述，TRIM11可以促進骨肉瘤的增殖，延長細胞周期，其機制可能與Cell cycle 和MAPK 信號通路的激活有關，TRIM11有望為骨肉瘤的治療與預后提供了新的途徑。