cfDNA 含量測定在妊娠期肝內膽汁淤積癥中的應用

凌寅杰，陳冬嬋，鮑婷婷，潘皆慰，袁琛

妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）是一種妊娠期內較為常見的并發癥，極易導致早產、宮內窘迫，增加圍產兒的死亡率，同時對孕婦的健康造成一定的損害[1]。近年來研究表明，患有ICP 的孕婦外周血及其新生兒臍血膽汁酸水平明顯升高，膽汁酸的毒性作用會影響胎兒心臟功能[2]，還會導致胎兒胰腺內分泌功能的異常。外周血游離DNA（cfDNA）的相關檢測在產前診斷和腫瘤研究中已經取得了很多研究進展[3]，而對于cfDNA和ICP及新生兒血清總膽酸（TBA）、膽汁酸（CA）之間的關系的研究尚未有報道。本研究探討cfDNA 含量與ICP 的關系，同時對于孕婦外周血cfDNA 含量與新生兒TBA、CA 濃度的相關性進行分析，為臨床診斷及預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014 年7 月至2019 年6 月浙江省湖州市婦幼保健院收治的妊娠期膽汁淤積癥（ICP）377 例為研究組，另選取同期正常孕婦105 例作為對照。研究組均符合《妊娠期肝內膽汁淤積癥診療指南（2015）》[4]中的相關標準，年齡20 ～42 歲，平均（28.8±1.3）歲；孕周30 ～40 周；其中初產婦204例，經產婦173 例。對照組年齡19 ～39 歲，平均（27.5±1.5）歲；孕周31 ～41 周；其中初產婦61 例，經產婦44 例。兩組一般資料差異均無統計學意義（＞0.05），入選孕婦及家屬均簽署了知情同意書，本研究經湖州市第一人民醫院及湖州市婦保院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 TBA、CA水平檢測 孕婦臨產后于清晨空腹采靜脈血1ml，胎兒娩出后采臍動脈血1ml。及時離心分離血清（2500 r/min，5min），利用HXD02 貝克曼A全自動生化分析儀測定血清TBA和CA水平。

1.2.2 cfDNA濃度及完整性檢測 孕婦臨產后抽取肘靜脈血1 ml，胎兒娩出后采臍動脈血1 ml，將所采外周靜脈血置于EDTA 管中，離心（2 500 r/min，5 min）后取血清，利用FirePure Circulating Free DNA Mini Kit 試劑盒（蘇州）提取cfDNA，每個標本最終洗脫體積為50 l。提取的DNA 經NanoDrop ND-1000 核酸定量儀測定吸光度（A260/A280），取比值為1.6 ～1.8 的樣本并對各樣本濃度進行測定。cfDNA 完整性檢測采用RT-PCR 技術測定血漿ALU115 基因（115bp）和ALU247 基因（247bp）濃度，以ALU115/ALU247 表示cfDNA 的完整性。ALU247 及ALU115 引物設計、合成及RT-PCR 方法見參考文獻[5]。

1.3 統計方法 采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，采用 檢驗；相關系數利用Correl 方程[6]計算。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦和新生兒血清TBA、CA水平比較 研究組孕婦血清TBA、CA水平均高于對照組（均＜0.05）。研究組新生兒臍靜脈血TBA、CA 高于對照組（均＜0.05）。見表1 ～2。

表1 兩組孕婦血清TBA、CA 濃度檢測 mol/L

表2 兩組胎兒臍靜脈血TBA、CA 濃度檢測 mol/L

2.2 兩組孕婦、新生兒cfDNA 水平 兩組孕婦cfDNA完整度差異無統計學意義（≤1.549，均＞0.05）；兩組新生兒臍靜脈血cfDNA 完整度差異有統計學意義（≥2.766，均＜0.05）。研究組孕婦cfDNA 含量（33.14±5.07）ng/ml，新生兒的cfDNA含量（30.15±4.20）ng/ml；對照組孕婦cfDNA含量（18.54±3.05）ng/ml，新生兒的cfDNA 含量（15.00±2.18）ng/ml。研究組產婦、新生兒cfDNA含量均高于對照組（=4.456、3.045，均＜0.05）。見表3。

表3 各組血漿cfDNA 完整度比較

2.3 孕婦cfDNA水平與新生兒TBA和CA 濃度之間的相關性 研究組孕婦cfDNA 水平與新生兒TBA 濃度與新生兒CA 濃度呈現正相關關系（=0.9805、0.9926，均＜0.05）。

3 討論

ICP在我國較為高發，已被認為屬于高危妊娠，臨床醫生可以通過孕期檢查及時診斷、孕期密切監護患者及胎兒宮內情況、積極保肝治療及適時終止妊娠等方式降低ICP 患者的并發癥，降低圍產兒病死率[7]。ICP 臨床表現為血清TBA、CA增高，可達數倍甚至數10 倍[8]。CA的淤積會導致胎兒心肌損傷、心功能異常，而TBA 的升高會影響胎兒胰腺分泌功能變化，影響胎兒的生長發育[9]。本研究結果顯示ICP孕婦血清TBA、CA水平明顯高于正常孕婦，CA 增高達20 倍以上，研究組新生兒TBA、CA 水平也顯著增高。這證明母體發生ICP 可使胎兒發生高膽汁酸血癥。但目前臨床仍對ICP的發病機制不甚明了，可能由環境因素、多胎妊娠、營養狀態、免疫功能狀態以及遺傳代謝等多因素作用導致[10]。

cfDNA 檢測在疾病的監控、胎兒的產前診斷及腫瘤的研究中已經有了很多應用，但是其含量測定與ICP 的關系研究甚少。本研究結果顯示研究組孕婦和新生兒臍靜脈血cfDNA 含量較對照組顯著升高，且研究組孕婦外周血cfDNA含量與新生兒TBA、CA 存在正相關。這提示ICP 患者的cfDNA 水平升高可能是導致孕產婦和新生兒膽汁淤積的一個重要原因。由于cfDNA 的產生來源于細胞凋亡，故推測ICP 的機制是否和妊娠期細胞凋亡增加有關。目前研究表明，胎盤滋養細胞的異常凋亡可能與ICP 的發生及病程的進展密切相關[11]。這也從間接證明本研究的正確性。但直接的證據需要侵入性的操作獲得，這就限制了進一步的臨床研究。今后的研究方向更需進一步觀察cfDNA 水平的異常和孕婦病情及新生兒健康程度的相關性。

綜上所述，ICP對母嬰特別是對胎兒危害極大，若處理不及時會導致新生兒并發癥、甚至病死。因此，臨床應早期診斷、早期處理，以達到緩解瘙癢癥狀、恢復肝功能、降低膽汁酸水平、降低cfDNA含量，同時要注意胎兒宮內的監護，及時發現胎兒異常癥狀并采取相關措施，以改善妊娠結局。