細胞蠟塊聯合免疫組化技術在肺癌胸水細胞學檢驗中的可靠性分析

張艷勝，胡赟

肺癌屬于我國發病率最高且臨床最常見的一種癌癥，15%的肺癌患者在就診時已經存在胸腔積液，50%左右的患者在疾病發展過程中也會出現胸腔積液[1-2]，這時患者已經錯過了最佳的手術切除時機，嚴重影響后期的預后。所以及早發現疾病，及時采取有效的治療，對控制疾病發展，改善患者預后具有至關重要的作用[3]。胸水、痰液及支氣管灌洗液等細胞學標本為疾病確診的關鍵線索[4-5]。但是目前傳統細胞學制片技術尚不完善，存在諸多的缺點，很難保障診斷的準確性[6]。為了解決這一問題，本研究以確診肺癌患者的胸水標本為研究對象，探討細胞蠟塊聯合免疫組化技術在臨床診斷中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016 年2月至2019 年12 月浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院確診的肺癌患者116例，并收集患者的胸水標本，男76例，女40 例；年齡29 ～86 歲，平均（54.0±10.6）歲。納入標準：（1）入院后均接受活檢病理診斷確診為肺癌；（2）簽署知情同意書。排除：（1）臨床資料不完整；（2）合并嚴重呼吸系統疾病；（3）合并嚴重心腦血管疾病者。

1.2 方法 對116 例胸水標本分別采用薄層液基細胞學沉降式制片技術和制備成細胞蠟塊后結合免疫組化染色技術進行檢查。

1.2.1 薄層液基細胞學沉降式制片 選取100 ml 的新鮮胸水標本，將其放置在專用的保存液中，勻速搖晃，確保兩種液體充分混合。之后取50 ml 混合液，采用1 500 r/min 的速度離心，時間5 min，離心后去除上清液，直至約剩余2ml，搖晃均勻。把混勻的標本放入制片器中，接著將盛有混勻標本的制片器對稱的放入液基細胞薄層制片機中，采用1000r/min的速度離心，時間3 min，等時間到后取出制片器，拆取玻片，待玻片稍干后將制好的玻片立即放入95%的乙醇中固定10 min。然后依染色程序，蘇木素染色3 min，PBS 返藍，水洗后放入伊紅染色30s，再經由低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 細胞蠟塊聯合免疫組化染色 將薄層液基細胞學沉降式制片后剩余的胸水樣本添加到保存溶液中，靜置在4 ℃冰箱內，直到細胞能夠完全被沉淀，之后將上清液全部除掉，接著加入10 ml 95%的乙醇以2 000 r/min 的速度完成離心，離心時間5 min，靜置30 min，取出沉淀物用棉紙包好放進包埋盒，在萊卡脫水機中快速處理3h后進行常規包埋，完成切片。TTF-1、CK7、CK5/6、Ki-67 抗體均購于福州邁新生物技術有限公司；采用MaxVision法對細胞蠟塊進行免疫組化手工染色。把蠟塊切成均勻3 m 厚度的蠟片，防脫玻片裱片，二甲苯完成脫蠟，行常規由高到低梯度乙醇水化，蒸餾水水洗后放入已煮開的新鮮配置的1∶50的EDTA液中，不銹鋼鍋蓋不要蓋緊，最小火加熱20 min，時間到后，關掉電磁爐，令其自然冷卻，接著蒸餾水水洗3 次，3 min/次，放入濃度為3%的H2O2中室溫下孵育時間10min，PBS緩沖液沖洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加一抗TTF-1、CK7、CK5/6 及Ki-67，室溫下孵育時間60 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，3 min/次，除去PBS，切片上滴加MaxVison-HRP，室溫下孵育時間15min，PBS緩沖液沖洗3 次，3min/次，除去PBS，切片上滴加新鮮配置的DAB顯色試劑顯色時間10min，流水沖洗終止顯色，接著蘇木素染色1 min，PBS 返藍，由低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標 以活檢標本病理診斷為“金標準”，對比兩種不同制片方法的診斷準確率及染色效果。

1.4 統計方法 采用SPSS20.0 統計軟件進行分析，計數資料采用2檢驗＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種不同方法制片的染色效果薄層液基細胞學沉降式制片的圖像清晰度高，細胞均勻，且細胞形態良好，但是缺少一定的成團結構和腺樣結構（封四彩圖3）；而細胞蠟塊結合免疫組化染色法的圖片染色清晰度高，細胞數目多且均勻分布，而且還可以在多數切片中直觀地觀察到細胞具體的排列方式和結構（封四彩圖4）。

圖3 薄層液基細胞學沉降式制片（HE 染色，×10）

圖4 細胞蠟塊結合免疫組化染色制片（免疫組化染色，×10）

2.2 兩種不同方法制片的診斷準確率比較 細胞蠟塊結合免疫組化染色法的準確率為79.31%（92/116），高于薄層液基細胞學沉降式制片的62.07%（72/116）（2=8.32，＜0.05）；在細胞蠟塊聯合免疫組化診斷中，腺癌64 例、鱗癌、腺鱗癌、未分化癌及不確定類型分型中，腺癌的準確率最高（91.43%），8 例肺癌無法分型。見表1。

表1 兩種不同方法制片的診斷準確率比較 例

3 討論

本研究結果顯示，采用細胞蠟塊聯合免疫組化染色法的診斷準確率高于薄層液基細胞學沉降式制片（＜0.05），這說明細胞蠟塊與免疫組化染色法聯合診斷能夠有效檢出細胞的具體結構，解決傳統檢測技術存在的缺陷和弊端，提高診斷的準確率。兩種不同制片方法可以相互補充，提高診斷的準確率，實現組織學活檢的目的，為醫生對腫瘤組織分型、判斷腫瘤的來源及對癥治療提供有力的依據[7]。對于晚期肺癌患者，體腔積液屬于主要的臨床表現，采用傳統細胞學檢查只能為醫生診斷惡性腫瘤提供有力依據，無法為醫生及時發現原病灶提供數據支撐，但是由于細胞蠟塊組織切片能夠反復、連續性的操作，而且采用細胞蠟塊技術檢測不會出現細胞丟失的現象，也能將少數的惡性細胞有效檢出，避免出現漏診和誤診[8-9]。

在臨床診斷過程中由于受到腫塊表面壞死，經氣管鏡下無法直接觀察到腫塊，難以獲取組織活檢標本，并且無法對組織標本的病理組織進行分型，不利于后期的診斷和治療。采用細胞蠟塊聯合免疫組化染色可有效解決該難題，提高診斷的準確率，為后期治療提供有力依據。所以在傳統診斷技術的基礎上聯合細胞蠟塊診斷法，可為及時找到原發病灶提供重要的線索；同時也可以對細胞組織進行分型，加強對分子病理的檢測，為后期個性化治療提供有力的依據。由此可見，該診斷方法在臨床上具有顯著的應用價值。制作細胞蠟塊過程中也有幾點需特別注意：（1）離心時轉速應＜2 500 r/min；（2）離心管要首選漏斗狀的，如果有血性的標本，要首先去除紅細胞，取出細胞團塊時最好采用頂針捅出的方法。

綜上所述，對于肺癌胸腔積液患者，細胞蠟塊聯合免疫組化染色診斷有一定的臨床應用價值，能夠為患者的診斷和癌癥分型提供有力的支持，從而可以及時采取有效的方法進行治療。