循環腫瘤DNA在惡性腫瘤早期診斷和預后的研究進展*

蔡一丹，易 帆 綜述，謝小兵 審校

1.湖南中醫藥大學醫學院,湖南長沙 410208;2.湖南航天醫院檢驗科，湖南長沙 410205； 3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗與病理中心，湖南長沙 410007

隨著人們生活水平提高和壽命的延長，癌癥成為威脅人類健康的主要疾病之一，腫瘤的檢測和治療也成為人類面臨的世界性醫學難題。已有的檢測方法有的檢出率較低，有的存在侵入性傷害，具有一定的局限性[1]。尋求一種非侵入性檢測方法，對惡性腫瘤進行早期篩查、診斷以便早發現、早治療，是研究人員一直不斷努力的方向。循環腫瘤DNA(ctDNA)分子檢測作為新一代體液活檢技術，由于具有微創、信息全、可重復性等優勢，近年來受到腫瘤生物學和腫瘤臨床醫學工作者的重視。本文就近年來關于ctDNA的生物學特征、檢測方法及在常見惡性腫瘤臨床中的早期診斷、預后評估及用藥指導方面的研究進展進行綜述。

1 ctDNA的發現和生物學特征

ctDNA是腫瘤患者血液中游離的來自腫瘤細胞的DNA。健康人體中均存在一類細胞游離DNA(cfDNA)，它們是可以存在于血液或其他體液中并游離于細胞之外。通常血液中的cfDNA主要由壞死和凋亡后的白細胞釋放入血液中，在某些疾病(如心肌梗死、冠心病)及特殊狀態下(如急性劇烈運動、妊娠)，其他細胞也會釋放cfDNA入血液。MANDEL等[2]于1948年首次報道了健康個體外周血中存在cfDNA。LEON等[3]1977年發現腫瘤患者血清中cfDNA的水平顯著升高。10多年后，VASIOUKHIN等[4]和SORENSON等[5]相繼在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征和胰腺癌患者外周血cfDNA 中發現了ras基因的突變，科學工作者將從腫瘤細胞脫落釋放入體液中的一類cfDNA稱為ctDNA。有研究發現，腫瘤患者無論其處于腫瘤進展的哪個階段、何種類型的實體瘤均存在ctDNA水平的顯著升高，并證實隨著腫瘤的進展，ctDNA的水平不斷升高[6-7]。然而，ctDNA釋放到血液中是隨機過程還是經過某種特定生物學程序加工后再釋放，仍是腫瘤生物學中一個有爭論的課題[8]。

ctDNA中常包含有突變、缺失、插入、重排、拷貝數異常及甲基化等相關DNA突變信息[9]。ctDNA片段一般為166 bp的核酸序列，其半衰期為16 min至2 h不等。由于血漿中存在核酸酶，單獨以DNA形式存在的ctDNA片段大多易被降解，ctDNA大多以DNA和蛋白質結合形成DNA-蛋白質復合體的形式存在。健康人體在免疫系統特別是巨噬細胞的吞噬和溶酶體的清除作用下，血液中的ctDNA水平較低。腫瘤患者ctDNA水平顯著升高，一方面機體腫瘤細胞在以指數方式倍增，腫瘤細胞的代謝、凋亡和壞死的量及釋放進入血液的循環腫瘤細胞也以同樣的方式倍增，循環腫瘤細胞播散及壞死釋放的DNA超出了機體正常的清除能力；另一方面，腫瘤患者機體免疫系統的功能大多異常，導致腫瘤患者血液ctDNA顯著升高。有研究表明，健康人血液中cfDNA水平多為1～100 μg/L，而腫瘤患者血液中ctDNA 濃度可達1 000 μg/L，平均為180 μg/L[10]。

2 ctDNA的檢測方法

腫瘤是一種由于體細胞的基因異常產生的病變，這些突變的體細胞DNA，只存在于癌前細胞或癌細胞基因組中，同一機體的其他正常細胞基因組則不會出現，這保證了ctDNA 能以特有的生物特異性成為腫瘤診斷的生物標志物。因此，理論上所有用于鑒定體細胞DNA變異的分子生物學技術都可以用于ctDNA的檢測。然而，由于體液中ctDNA水平非常低，通常ctDNA只有cfDNA的0.01%～1.00%，常規基因測序技術如Sanger法、焦磷酸測序只能用于高負荷腫瘤檢測或是高豐度ctDNA突變片段分析，使其推廣和臨床應用受到了極大限制。近年來，隨著DNA 測序技術和分子診斷技術的快速發展，對痕量DNA 分子進行定量分析已經有了多種選擇。當前常用的可用于ctDNA檢測和分析技術有第二代的高通量測序法(NGS)、磁珠捕獲法(BEAMing)[11]、微滴式數字PCR技術[12](ddPCR)、低溫變性下復合PCR技術(cold-PCR)[13]。

2.1NGS NGS技術具有通量高、檢測速度快、成本較低等優點，被廣泛應用于各種體液標本DNA的分析。NGS主要包括DNA連接，DNA文庫構建，克隆模板擴增和大規模平行測序。NGS平臺可執行大規模的DNA并行測序，以實現對來自樣品的數百萬個DNA片段進行統一測序和對未知突變的篩查，并分析基因的遺傳多態性。NGS技術的應用主要有兩個：一是進行基因組靶序列捕獲測序，設計合適的芯片探針，可實現對一個或多個已知致病基因進行測序；二是進行全外顯子組測序或全基因組測序，前者可用于研究基因組的蛋白編碼區域，從而揭示對疾病和群體健康的遺傳影響，后者可對不同個體或者是群體進行全基因組序列分析和生物信息學分析，可全面挖掘基因組的各類變異[14]。

2.2BEAMing BEAMing 技術是利用磁珠來吸附游離DNA，其探針是一條序列已知的單鏈固定在固相(芯片、微珠)表面，另一條樣品中的單鏈來與其雜交配對。它可以從數萬個正常細胞DNA中檢測出有基因突變的ctDNA 分子。GARCIA等[15]對183例已知EGFR突變的非小細胞肺癌患者，分別采用BEAMing和NGS方法檢測患者ctDNA中T790M EGFR基因突變，檢測陽性率分別為21.8%和10.9%。

2.3ddPCR ddPCR技術是先將DNA鏈模板稀釋到單個模板分子并分配到大量獨立的反應單元中，即先對標本微滴化處理，再進行PCR擴增，擴增結束后對每個獨立反應室熒光信號進行統計學分析，最后定量DNA拷貝數。ddPCR不依賴擴增的循環閾值(Ct)，不需內參和標準曲線，具有準確度高、重現性好和絕對定量分析等優點[16]。ddPCR和優化的NGS在ctDNA分析中也各有優缺點。與NGS相比，ddPCR實驗更容易建立，速度更快，敏感度更高，分析不需要復雜的信息學支持。BETTEGOWDA等[17]報道，采用ddPCR技術，超過80%的晚期結直腸癌、黑色素瘤和胰腺癌患者中可以檢測到血漿ctDNA中與癌癥相關的熱點基因突變。與此類似，VESSIES等[18]也在黑色素瘤、結直腸癌、肺癌和胰腺癌中檢測到血漿ctDNA中相關基因的突變。

2.4cold-PCR cold-PCR技術是在高豐度野生型DNA片段背景下選擇性變性并擴增低豐度突變型DNA片段序列的方法，cold-PCR技術可將突變型序列富集10～100倍。基于突變片段Tm值的改變和異源雙鏈DNA分子的形成，cold-PCR可富集擴增片段中所有類型和位置的突變，也可富集未知突變，具有敏感高、特異性強、精確度高、低成本和易操作等優點[19-20]。SEFRIOUI等[21]采用ddPCR技術和cold-PCR技術定量分析了29例結直腸癌患者血清ctDNA中Kras基因突變，發現cold-PCR可以準確地檢測和量化ctDNA的低豐度基因突變，在保證定量分析準確性的前提下可快速得出分析結果。

3 ctDNA在惡性腫瘤臨床應用中的進展

由于ctDNA中包含患者腫瘤的全部遺傳學信息，利用ctDNA做為腫瘤標志物，分析其突變、缺失、插入、倒位及甲基化等表觀遺傳學改變，在腫瘤的早期篩查、預后以及用藥指導等各方面可以發揮重要作用。

3.1ctDNA作為惡性腫瘤早期診斷的生物標志 近年來，關于疾病生物標志物的研究一直是臨床醫學研究的熱點、重點和難點。特別是精準醫療的概念提出后，腫瘤生物標志物相關研究計劃被列入了國家“973”計劃、國家重點研發計劃、科技部重大專項計劃等[22]。這些生物標志物是疾病復發、進展或預后評估中的指示因子。來自腫瘤的ctDNA能在一定程度上代表腫瘤的整個基因組格局，并且可以用作液體活檢來分析腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學改變，包括癌基因或抑癌基因的突變、甲基化及基因擴增等。在過去的幾年中，ctDNA作為有效且可靠的生物標志，在對特定患者進行分型，指導臨床早期診斷和治療及預后的評估中發揮了關鍵作用。利用ctDNA生物標志，早期檢測特定類型癌癥的表觀遺傳學異常，如癌基因或者抑癌基因中啟動子的低甲基化，可以為腫瘤生物學研究和臨床治療提供重要信息。多項研究表明，在肝癌患者外周血ctDNA中，常見TP53[23]、ITH[24]、HCK[25]和TNNB1[26]存在特異性突變，提示可以檢測患者外周血ctDNA來早期診斷肝細胞癌變。GORMALLY等[27]報道了檢測血漿ctDNA，最早可以提前2年發現健康受試者的Kras基因突變，提前在癌癥診斷之前的20.8個月發現健康患者TP53的突變。早期腫瘤或腫瘤微轉移的晚期患者雖然血漿中只含有較低豐度的ctDNA片段，但是隨著DNA檢測技術的不斷進步，對痕量DNA定量定性分析也成為可能[28]。

3.2ctDNA在惡性腫瘤預后評估中的作用 臨床醫生根據影像和組織標本檢測中得到的信息，結合臨床觀察、腫瘤進展分期、組織病理學改變和生物分子特征等可以對不同癌癥患者的預后進行評估。當組織切片不易獲得(如非實體瘤)，或者保存的組織切片基因分析遇到困難，利用患者血液檢測ctDNA的重要性就得到顯現。BETTEGOWDA等[17]的研究表明，ctDNA 可在超過75% 的非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結直腸癌、肝癌及頭頸癌中檢測到。已有研究證明，ctDNA具有一系列與腫瘤相關的分子生物學特征：ras 基因及TP53基因的突變，p14、p16、APC基因過甲基化，等位基因雜合性缺失(LOH)及mtDNA 改變等現象[29]。非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，大約1/3都有Kras基因突變，GAUTSCHI等[30]研究了180 例肺癌患者ctDNA 發現Kras突變與患者預后不良有關。PARKINSON 等[31]對40例惡性復發性高級別漿液性卵巢癌患者TP53基因ctDNA突變情況分析，顯示在化療1個療程后，TP53突變等位基因分數下降>60%的患者有更長的無復發生存期。MORIKAWA等[32]對卵巢透明細胞癌患者血漿PIK3CA和Kras基因ctDNA檢測結果顯示，細胞高水平PIK3CA-H1047R或KRAS-G12D 的ctDNA患者有更短的生存期。一系列的研究表明，胰腺癌患者血漿ctDNA含有Kras基因突變并且Kras基因的突變可以用來監測胰腺癌的發展[33-34]。DABRITZ等[35]檢測了56例胰導管腺癌患者及13例胰腺炎患者血漿ctDNA中Kras基因突變，胰導管腺癌中檢測到20例患者的Kras基因有突變，而在胰腺炎患者中均無Kras基因的突變。在結腸直腸癌的研究方面，TROJAN等[36]比較了37例結直腸癌患者血液ctDNA中Kras基因突變及CDKN2A啟動子的超甲基化情況，發現Kras基因有突變和(或)CDKN2A啟動子有超甲基化的患者，其2年生存率為48%，而二者沒有發生改變的患者，其2年生存率為100%。

3.3ctDNA在惡性腫瘤治療中用藥指導作用 近年來，腫瘤藥物在傳統的放療、化療的藥物基礎上呈現多樣化、個性化和精準化的趨勢，選擇安全、療效可靠的藥物是腫瘤臨床治療面臨的重要挑戰。作為一種生物標志，患者外周血中ctDNA水平及不同類型腫瘤相關基因的變異特征都能有效反映腫瘤的變化，ctDNA檢測在腫瘤手術治療或者藥物治療后療效評估中顯示出了其誘人的應用潛力。

有研究表明，晚期結直腸癌患者ctDNA檢測分析能反映腫瘤進展狀況及術后預后評估，也能指導靶向藥物的治療方案及尋找耐藥發生機制，通過檢測Kras基因野生型和突變型來研究晚期結腸癌EGFR 阻斷劑耐藥突變的出現[37]，對可能產生的耐藥位點基因突變進行檢測，并追蹤耐藥突變基因。BETTEGOWDA等[17]對晚期結腸癌患者Kras、BRAF、NRAS、EGFR和PIK3CA的所有外顯子進行分析，發現96%的晚期結腸癌患者的Kras或NRAS基因至少一個有突變。可見血漿ctDNA檢測對卵巢癌患者藥物選擇及藥物耐藥的預測能起到臨床用藥指導作用。

4 基于ctDNA檢測的腫瘤精準醫療在臨床應用中存在的問題和未來發展趨勢

4.1ctDNA檢測在腫瘤臨床應用中存在的問題

4.1.1研究的樣本量有限，限制了ctDNA在臨床的廣泛應用 盡管已有研究顯示，血漿ctDNA 與惡性腫瘤組織基因突變有高度一致性，但目前的研究大多處于實驗室研究階段，研究的樣本量較少，因此在惡性腫瘤患者中，血漿ctDNA檢測能否完全取代腫瘤組織的基因檢測從而進一步指導臨床診斷、治療和用藥仍需進一步的、前瞻性的臨床研究證實。

4.1.2檢測方法和觀察指標的穩定性、標準化還需要進一步提高 目前血漿ctDNA 檢測方法有多種實驗技術，各種惡性腫瘤血漿ctDNA檢測觀察指標不一，各種監測技術及觀察指標如何更加敏感、穩定、標準化地應用于評估腫瘤發生、發展的進程，仍需大規模、大樣本的臨床研究驗證。

4.2ctDNA檢測技術在腫瘤臨床應用中的發展趨勢 隨著腫瘤生物學、分子生物學及基因工程技術研究的不斷深入，以及轉化醫學的迅速發展，ctDNA 在惡性腫瘤診療過程中的作用將不斷受到重視。ctDNA檢測的快速、簡便、經濟、侵害性小、實時動態佳等優勢受到越來越多的科研工作者和臨床醫學工作者的關注。基于腫瘤患者血液ctDNA的監測策略將更全面、動態地反映腫瘤進展的演變過程，顯示腫瘤在早期診斷、預后、臨床用藥指導的價值。人類基因檢測技術的發展為腫瘤精準醫療提供了技術支撐。目前，基于NGS、BEAMing、ddPCR及cold-PCR技術等基因測量技術的發展，對基因的表達分析和檢測更加精準，為腫瘤的分型和精準治療提供了技術援助，隨著這些檢測技術的進步和更新，檢測成本的不斷降低，對腫瘤精準治療的實施將成為現實。