急性痛風患者NALP3炎癥小體表達及相關指標的價值研究

鐘 山，王正義，郭林旺，林 玉

中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院濱江分院全科，海南海口 571100

痛風是因為單鈉尿酸鹽晶體異常引起的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為嘌呤代謝和尿酸排泄異常以及障礙[1]。長期的高尿酸血癥會導致關節(jié)和周圍軟組織尿酸鹽晶體沉淀，進而反復出現(xiàn)急性關節(jié)炎，軟組織、關節(jié)損害，以及痛風石性關節(jié)炎[2]。而急性痛風則是病情發(fā)展快、疼痛劇烈，且伴隨C反應蛋白(CRP)和紅細胞沉降率(ESR)的升高，但是大部分患者可在一定時間內自行緩解，臨床上僅部分患者可由高尿酸血癥發(fā)展為急性痛風，所以尋找更加有效預測痛風的指標顯得較為重要[3]。CRP是一種急性時相反應蛋白，是機體出現(xiàn)炎性反應時最敏感的指標之一；ESR是指紅細胞在一定條件內的沉降速度，在急性痛風發(fā)作期可明顯升高[4]。血清核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NALP3)屬于大分子復合物，能夠充當半胱天冬酶-1活化的平臺，同時能夠起到促進白細胞介素(IL)-lβ、IL-18等炎性因子生成以及成熟的作用。既往有文獻顯示，NALP3在痛風、腎臟疾病當中起到重要的作用[5-6]。因此，本研究選取本院收治的152例急性痛風患者的臨床資料進行分析，探討急性痛風患者NALP3炎癥小體表達及相關指標的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年3月本院收治的152例急性痛風患者作為試驗組。納入標準：(1)符合《痛風的防治》[7]中痛風診斷標準；(2)年齡>18歲；(3)精神意識正常；(4)雙源CT檢查尿酸鹽結晶沉積情況，均發(fā)現(xiàn)尿酸鹽沉積，結晶沉積數(shù)量在120個以下；(5)臨床資料完整。排除標準：(1)存在惡性腫瘤、心肌梗死等重大疾病；(2)存在肺、腦、腎等重要器官障礙；(3)中途退出或死亡。另選取同期體檢健康者151例作為對照組。試驗組男75例，女77例；年齡31～68歲，平均(50.14±5.48)歲；病程10～19 h，平均(15.25±3.19)h。對照組男74例，女77例，年齡30～69歲，平均(50.21±5.51)歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有患者及其家屬知情且簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1NALP3 mRNA檢測 分別抽取兩組患者空腹靜脈血2.5 mL，高速離心分離血清，參考TIANamp Blood DNA Kit說明書提取DNA，-70 ℃保存。采用熒光定量PCR檢測NALP3 mRNA相對表達水平。參考GenBank中NALP3 mRNA的序列，采用Primer Express2.0軟件設計引物，NALP3上游引物為5′-CCCCGTGAGTCCCATTA-3′，NALP3下游引物為5′-GAC-GCCCAGTCCAACAT-3′。內參基因GAPDH上游引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物為5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。逆轉錄反應條件：45 ℃，持續(xù)45 min。采用熒光定量PCR測定NALP3 mRNA相對表達水平。95 ℃，預變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火，72 ℃延伸45 s，連續(xù)40個循環(huán)。PCR完成后，分析擴增曲線對應循環(huán)閾值(Ct值)。

1.2.2NALP3蛋白檢測 分別抽取兩組患者外周血2.5 mL，提取外周血單個核細胞進行蛋白定量檢測，嚴格按照蛋白抽提試劑盒說明書提取細胞總蛋白，使用BCA法進行蛋白定量。取50 μg細胞總蛋白進行電泳，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉孵育1.5 h；采用NALP3抗體(武漢博士德生物工程公司)及GAPDH抗體(美國Abcam公司)4 ℃孵育過夜。第2天加入被辣根過氧化酶所標記的二抗，孵育1 h，隨后進行ECL化學發(fā)光顯色，應用Image J軟件進行圖像分析。

1.2.3實驗室檢查 觀察兩組受試者尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ESR、CRP水平。抽取兩組受試者空腹靜脈血3.5 mL，高速離心分層，分離血清，送至檢驗科，應用美國貝克曼有限公司的AU5800檢測UA、ESR、LDL-C、HDL-C水平；應用泰康醫(yī)學系統(tǒng)股份有限公司的血糖檢測儀檢測FPG水平；應用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測CRP水平，人CRP ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。參考《常見疾病的實驗室檢查》[8]中實驗室指標正常范圍。UA正常范圍：<420 μmol/L；FPG正常范圍：3.9～6.1 mmol/L；LDL-C正常范圍：<3.41 mmol/L；HDL-C正常范圍：1.16～1.42 mmol/L；ESR正常范圍：<20 mm/h；CRP正常范圍：<2.87 ng/L。

2 結 果

2.1兩組患者實驗室檢查指標的比較 兩組患者FPG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；試驗組UA、ESR、CRP水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者實驗室檢查指標的比較

2.2兩組患者血清NALP3 mRNA和蛋白質表達情況比較 試驗組NALP3 mRNA表達水平及NALP3蛋白表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、圖2。

圖2 兩組NALP3蛋白表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3急性痛風獨立危險因素分析 經多因素Logistic回歸分析，NALP3炎癥小體、UA、ESR和CRP是導致急性痛風的獨立危險因素。見表3。

表3 急性痛風的獨立危險因素分析

2.4NALP3炎癥小體表達水平與血清指標相關性分析 Spearman相關性分析顯示，健康者和急性痛風患者NALP3 mRNA的表達水平與UA、CRP、ESR均呈正相關(r=0.559、0.548、0.727，P<0.001)。

3 討 論

痛風是目前風濕免疫科較為常見關節(jié)炎性疾病之一，臨床表現(xiàn)為關節(jié)周圍紅腫、劇烈疼痛等，往往在1周左右可自行緩解，但是隨著時間的變化，痛風的次數(shù)會逐漸增加，出現(xiàn)痛風石，最終引起關節(jié)畸形[9]。痛風急性發(fā)作期存在較為明顯的特異性，急性發(fā)作期患者患病側關節(jié)可出現(xiàn)紅腫、灼燒以及疼痛感導致行動受到限制，如果影響到大關節(jié)甚至會引起滲液，患者多伴隨發(fā)熱的癥狀，往往會出現(xiàn)寒戰(zhàn)、倦怠、頭痛等情況，由于痛風急性發(fā)作期出現(xiàn)的皮膚暗紅也會隨之消失，大部分患者會出現(xiàn)脫屑、瘙癢等情況[10-12]。通常采用激素類藥物進行治療痛風急性發(fā)作期患者，雖可緩解病情，但其治療效果受到治療是否及時的影響，因此對于痛風急性發(fā)作的預測和診斷顯得極其重要[13-15]。

NALP3炎癥小體屬于炎性復合體的一類。痛風性關節(jié)炎生成的尿酸炎結晶體是一種活化劑，能夠活化炎性體，促進活性氧簇的分泌，激活NALP3的炎性信號通道，進而促進TNF-α、TL-1β等一系列炎性因子的分泌，使機體的炎性反應得到進一步擴大[16]。NALP3炎癥小體的主要由NALP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)組成，這3種因子均能抑制IL-1β的成熟，表明NALP3炎性體與痛風炎性反應緊密相關，而有研究證實IL-1β能夠促進炎癥因子的分泌，引起炎癥應答，與痛風急性發(fā)作密切相關[17]。本研究結果顯示，試驗組NALP3 mRNA及蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且NALP3炎癥小體是痛風急性發(fā)作的獨立危險因素，與據(jù)李芳等[18]研究一致。提示痛風的急性發(fā)作期同樣與NALP3炎癥小體的表達升高有關。UA水平的升高是痛風的主要特征之一，本研究結果顯示，相比于對照組，試驗組UA水平顯著升高，且UA是痛風急性發(fā)作的獨立危險因素，分析原因，UA的代謝異常會導致尿酸鹽結晶堆積于關節(jié)腔內部，促進炎性因子，進而引發(fā)痛風急性發(fā)作[19]。CRP是一種在IL-1、IL-6等炎性因子刺激下由肝細胞所合成的蛋白，健康人體內表達水平較低，但是在患者體內出現(xiàn)炎性因子的情況下，其水平會急劇升高。ESR升高多見于各種炎癥。本研究中，試驗組CRP、ESR水平較對照組顯著升高，提示其能夠作為痛風急性發(fā)作的檢測指標。本研究結果還顯示，痛風急性發(fā)作期體內NALP3 mRNA的表達與患者UA、CRP、ESR呈正相關。分析原因：患者在痛風急性發(fā)作期體內，因為炎性反應導致NALP3 mRNA的表達急劇升高，而在炎性反應的促進下，CRP水平急劇升高，ESR也隨之升高[20]。

綜上所述，NALP3炎癥小體在急性痛風患者中的表達水平明顯升高，NALP3炎癥小體、血清UA、ESR、CRP是急性痛風的獨立危險因素，同時NALP3炎癥小體與UA、ESR、CRP的表達水平呈正相關。