循環腫瘤細胞上皮間質轉化的研究進展

李奇棟，許慶文，孫利君（廣東醫科大學附屬醫院胃腸外科，廣東湛江 524000）

由于人口老齡化和工業化的進展，生活方式的改變等原因，惡性腫瘤已成為嚴重威脅全世界人群健康的主要公共衛生問題之一。根據GLOBOCAN 2018顯示，全球惡性腫瘤新發病例約1808萬例，死亡病例約956萬例[1]，中國新發與死亡病例分別約占23.7%和30.0%，發病率均高于世界平均水平。面對這一嚴重問題，腫瘤的早期診斷與及時治療成為了關鍵。近些年來，生物技術獲得巨大進展，隨著精準醫療的大力推進，腫瘤的“液體活檢”被提出并且備受關注，其中循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)作為“液體活檢”的一種，CTCs只需抽取患者少許靜脈血作為標本即可，且具有特異性強的特點。隨著近些年來，關鍵技術問題的解決，CTCs在臨床的應用逐漸興起。

1 CTCs

1869年，澳大利亞病理學家 Thomas Ashworth首次提出了循環腫瘤細胞，是指由實體腫瘤細胞受到細胞內外多種細胞因子的作用和調控下從腫瘤組織脫落或進入血液循環，而這其中絕大多數的腫瘤細胞在免疫系統的識別殺傷及自身凋亡的作用下死亡，只有極為少數的腫瘤細胞存活下來，這些細胞具有極高的侵襲作用和轉移傾向，它們發生黏附、聚集并在特定的條件下形成腫瘤微栓，繼而實現了腫瘤的侵襲轉移[2]。相比傳統的輔助檢測外周血中的CTCs快捷無創，對于早期發現腫瘤、動態檢測療效和評估預后等都具有極高的臨床應用價值。

2 上皮間質轉化(EMT)

細胞通過下調上皮特性并獲得間質特性的想法是在 20世紀 80年代初由 Elizabeth Hay提出的，她描述了雞胚胎原始發育中上皮到間質的表型變化，從而提出 EMT[3]。EMT是指上皮表型細胞在一定條件的下出現上皮表型的特征蛋白表達下調而間質表型細胞的特征蛋白表達上調即細胞發生細胞極性丟失，使得運動能力增強的過程[4]。在這過程中，細胞不僅下調上皮表型蛋白的表達，同時改變其基因的表達程序，使得細胞骨架結構及形態學發生轉變，并改變細胞與細胞外基質的相互作用，從而促進細胞的遷移。EMT是胚胎發育(Ⅰ型)和傷口愈合(Ⅱ型)中不可或缺的一部分，并在病理上促進腫瘤的發生發展(Ⅲ型)。EMT的過程中復雜的細胞表型和分子標志物的變化是由多個轉錄因子調控的信號通路參與并調節其發生與變化。

2.1 EMT的效應蛋白

許多著名的 EMT效應蛋白都是亞細胞結構蛋白，這些蛋白可以區分細胞的上皮或間質表型。在EMT過程中，上皮表型的特征性蛋白的關鍵分子成分受到不同程度的調控。例如，E-鈣黏素(Ecadherin)、細胞角蛋白(Cytokeratin)、橋粒蛋白(Desmoplakin)和緊密連接蛋白(Occludin)等，都有不同程度的下調，其中 E-鈣黏素被認為是上皮細胞表型的關鍵，它維持著上皮細胞之間的穩定性和細胞極性[5]。當上皮來源的腫瘤細胞發生 EMT時，E-鈣黏素的基因轉錄受到抑制[6]，啟動子甲基化以及蛋白質磷酸化和降解都使其表達下調[7-8]，導致細胞的黏附連接的分解，編碼緊密連接蛋白和橋粒蛋白的基因亦受到抑制，這促進了緊密連接和橋粒連接的溶解。此外，E-鈣黏素的下調，證實可以讓從原位脫落的腫瘤細胞避免失巢凋亡的影響[9]。這些基因表達的變化抑制了上皮細胞的連接，并使其失去游離面-基底面極性[10]。

而一些非上皮性鈣黏素，如 N-鈣黏素(Ncadherin)，整合素β6(Integrin β6)在 EMT發生后表達增加[11]。具體來說，E-鈣黏素的下調被 N-鈣黏素的表達增加平衡[12]，經過這種平衡，細胞失去了與上皮細胞的聯系，獲得了對間質細胞的親和力[13]。與E-鈣黏素的作用相反，N-鈣黏素通過α-catenin和βcatenin與細胞骨架連接，N-鈣黏素還激活 Rho家族GTPase信號通路，增強成纖維細胞生長因子(FGF)信號通路，并調節 Wnt信號通路。纖維連接蛋白(Fibronectin)是間質表型細胞遷移所需的一種細胞外蛋白，經常在 EMT激活時被誘導。此外，在 EMT的過程中的中間絲組成隨著細胞角蛋白的抑制和波形蛋白(Vimentin)表達的激活而改變。

綜上所述，EMT效應分子的切換不僅有助于腫瘤細胞的運動，而且在某種程度上還促進它們在血流中的增殖和生存能力，從而增加了遠處轉移形成的可能性。

2.2 調控EMT的轉錄因子

EMT程序的執行使得細胞發生骨架的改變及形態學的轉變，而調控 EMT的轉錄因子逐漸被發現。總體來說，下面三類轉錄因子被證明是在 EMT過程中的關鍵，因此被認為是EMT的核心轉錄因子。

第一類是含有鋅指結構的 DNA結合蛋白 Snail，包括 Snail1和Snail2，它們在胚胎發育、傷口愈合、腫瘤發生發展期間激活 EMT。Snail通過羧基末端的鋅指結構域與E-鈣黏素基因啟動子區的E-box區域結合來抑制上皮表型基因，使 E-鈣黏素表達下降，除了抑制上皮表型基因外，Snail還激活了促進間質表型的基因，使得 N-鈣黏素表達上調[14-15]。多項研究表明，Snail的異常表達與乳腺癌[16]、肺癌[17]、結直腸癌[18]等多種腫瘤的 EMT、侵襲、轉移都密切相關。

第二類是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子 Twist，包括 Twist1和Twist2，過往研究顯示，Twist的作用于Snail相似，Twist表達下調上皮表型基因，激活間質基因表達，在癌細胞中，Twist抑制 E-鈣黏素并 N-鈣黏素的表達，并不依賴 Snail[19]。最近，有研究證明Twist可上調波形蛋白的表達，促使結直腸癌HCT116細胞及 SW480細胞形態學上轉變為代表間質表型的梭形，上調其侵襲能力[20]。該研究表明，Twist調控結直腸癌細胞的 EMT程序，促使其侵襲及轉移[21]。另有研究證明，缺氧誘導因子1α(hypoxia indu-cible factors1α，HIF1α)在缺氧條件下可誘導Twist表達[22]，從而促進 EMT。此外機械應激誘導果蠅黑腹上皮細胞中Twist表達，該方式依賴于β-catenin[23]。

第三類是 ZEB家族的ZEB1，屬于鋅指蛋白類的轉錄因子。ZEB1作為EMT的轉錄因子，其最顯著的作用是直接抑制 E-鈣黏素的表達，也有報道稱，ZEB1可以控制涉及EMT其他方面的基因表達，例如可直接激活波形蛋白、抑制極性蛋白1(protein associated with Lin seven 1，PALS1)及激活基質金屬蛋白酶如膜型基質金屬蛋白酶-1(membrane type-1 matrix metalloprpteinase，MT1-MMP)[24]，從而促進腫瘤轉移。

除了上述核心轉錄因子，還發現其他轉錄因子可以誘導或調節 EMT程序，其中有一部分屬于GATA家族，其特征是具有與DNA結合的雙鋅指結構域，控制著不同細胞的分化，它們通過調節上皮細胞之間的連接所需基因的表達來促進 EMT，還有一些是屬于 SOX家族，它們與Snail1和Snail2協同驅動EMT。這些新發現的轉錄因子對 EMT程序的調控作用，以及與Snail、Twist或 ZEB1的功能關系還沒有很好的確定。

總之，在 EMT過程中，不同的轉錄因子在不同類型的細胞或者組織下，通過不同的信號通路傳導有著不同的影響，它們互相調控彼此的表達，對目標基因上進行效應性整合，進而在轉錄水平上促進EMT過程。

2.3 EMT誘導物

一般認為，腫瘤細胞發生的 EMT是對腫瘤微環境中的細胞外信號作出的反應，這其中是多種信號通道共同合作的結果。轉化生長因子 -β(transforming growth factor-β)信號通路在腫瘤的 EMT過程中有著重要作用，通過是否存在 Smad介導的可以將TGF-β信號通路分為：Smad介導的 TGF-β信號通路，即TGF-β與細胞膜上 TGF-β受體Ⅱ結合，被活化的TGF-β受體Ⅱ募集并結合TGF-β受體Ⅰ，形成異源三聚體，使 Smad2/Smad3磷酸化，Smad4參與協助活化的 R-smad向核轉移并保持其轉錄活性，進入細胞核后使 Snail、Twist、ZEB1等轉錄因子表達增加，從而調控EMT[25]。其中Smad復合物不僅能激活特異性轉錄因子的表達，而且還能提高轉錄因子的活性，TGF-β通過 Smad3的轉錄誘導 Snail1的表達，而Smad3還可以間接誘導 Snail2的表達。Smad3-Smad4協同 Snail1，從而進一步增加 TGF-β的激活對 E-鈣黏素和緊密連接蛋白編碼蛋白的抑制作用。

非 Smad介導的 TGF-β信號通路，它是通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路進行轉錄調控[26-27]，進而激活 mTORC1和mTORC2，其中 mTORC1促進細胞發生形態學改變、蛋白質合成、運動性和侵襲性的增加，而 mTORC2是細胞由上皮表型轉變為間質表型所必需。另一方面，TGF-β刺激PAR6(維持上皮細胞極性和緊密連接的調節器)在細胞緊密連接處被TGF-β受體 II磷酸化，磷酸化后的 PAR6與其互相作用，導致緊密連接的喪失[28]。TGF-β還可以誘導RhoA的活性[29]，通過激活透明蛋白(DIA1)和Rho相關激酶(ROCK)來促進肌動蛋白重組，磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)，激活 LIM激酶(LIMK)，從而抑制絲切蛋白(cofilin)[30]。TGF-β還能通過影響其他誘導 EMT過程的信號通路，如 Notch、Wnt以及整合素信號通路等。除了TGF-β信號通路，Wnt/β-catenin信號通路亦被證明與EMT的誘導有關[31]。在 Wnt/β-catenin信號通路中，Wnt蛋白與特異性受體節結合，觸發細胞內的信號傳導，抑制GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)的活性，使β-catenin(β-連環蛋白)無法被降解而在胞漿積聚，并移向核內。游離的β-catenin在核內與轉錄因子 TCF/LEF結合，激活與EMT相關的靶基因，降低 E-鈣黏素的表達，參與EMT過程[32]。

通過受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)的生長因子也可以誘導 EMT。成纖維細胞生長因子(FGF)誘導膀胱癌細胞的EMT伴隨著Snail2的表達、橋粒蛋白的缺失[33]，肝細胞生長因子(HGF)通過 MAPK/ERK信號通路誘導 Snail1和Snail2的表達[34]，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)受體激活使乳腺上皮細胞下調 E-鈣黏素、同時上調 N-鈣黏素、波形蛋白及纖維連接蛋白[35]，表皮生長因子則是通過增加對 E-鈣黏素的內噬作用，以及通過Snail1和Twist的表達來下調 E-鈣黏素[36]。

腫瘤微環境也參與調節 EMT，腫瘤組織過快的生長導致組織缺氧，在缺氧條件下可通過 HIF1α激活 Twist的表達從而啟動 EMT[37]。HIF1α還可通過誘導卵巢癌細胞表達Snail1，致使 E-鈣黏素缺失[38]。炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)可通過 JAK-STAT通路誘導Snail1的表達促進EMT[39]。

3 結論與展望

綜上所述，EMT是由多種轉錄因子和信號通路共同形成的信號網絡，在這些信號網絡的調控下，腫瘤細胞發生細胞表型和分子標志物的變化，從而實現腫瘤的侵襲和轉移。充分了解 EMT的發生機制及其調節因素在腫瘤的侵襲轉移中的作用，以尋找出可以用于預測腫瘤轉移甚至治療腫瘤的某種關鍵因子。