血清IgG N-聚糖在腫瘤輔助診斷中的研究現狀

許軼涵，李 晨，郭釗培，郭智浩，廖雅楠 綜述,曹穎平 審校

1.福建醫科大學醫學技術與工程學院，福建福州 350000；2.福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科，福建福州 350000

癌癥一直是人類健康的一大威脅。在中國，肺癌、肝癌、胃癌、食管癌和結直腸癌等惡性腫瘤的發病率和病死率正在逐年上升[1]。研究表明，癌癥的早期篩查、早期診斷、早期治療對患者的五年生存率有積極意義[2]。但由于絕大多數癌癥的早期癥狀不夠典型，不能根據傳統的癌癥篩查手段及時作出診斷，導致治療方法受限。因此，能在癌癥早期就為診斷提供幫助的腫瘤標志物對提高患者的治療和生存質量有重要意義。

在過去的十幾年中，研究者們報道了大量與癌癥發生發展密切相關的生物分子，其中不乏一些高特異度、高靈敏度的腫瘤分子標志物，這些分子標志在腫瘤的早期診斷、療效觀察和預后判斷中有重要作用[3]。N-聚糖作為一種重要的翻譯后修飾蛋白，近年來也進入了研究者們的視野，其在腫瘤細胞中的免疫逃避、血管生成和細胞間的信號傳導過程中扮演著重要角色[4]。免疫球蛋白(Ig)G作為體內最重要的Ig之一，更是與癌癥的發生發展息息相關。大量的研究報道了疾病患者，特別是罹患惡性腫瘤的患者體內IgG N-聚糖存在著明顯的改變[5-17]，從這些發現可以看出，通過檢測IgG N-聚糖水平和組成的變化對腫瘤的早期輔助診斷意義重大。

1 IgG N-聚糖的生物學特性

大約有20%的人血清IgG存在N-聚糖，N-聚糖主要存在于其Fc段CH2區的Asn-297上[18]。組成N-聚糖糖鏈的單糖殘基有巖藻糖、甘露糖、唾液酸、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺等，生物體內的N-聚糖結構均以三甘露糖為核心，向外形成“天線”，根據“天線”的不同，N-聚糖分為高甘露糖型、復雜型和混合型3種[19]。IgG的Fc段介導了吞噬過程、黏附過程、細胞毒性作用及超敏反應等，其功能的正常發揮依賴于該區域的適當糖基化，Fc段N-聚糖發生改變即可影響相應的功能[20]。目前，研究發現了腫瘤患者IgG N-聚糖存在明顯改變，在腫瘤的發生發展過程中，這些改變使IgG和其他依賴FcyR的細胞功能出現異常，并與其他因素共同導致了腫瘤的發生[4,21]。

雖然N-聚糖的組成在生物體不同狀態下存在高度變異性，但是相同狀態下的不同個體的血清N-聚糖糖譜卻十分相似[22]。這使得特定疾病狀態下的N-聚糖糖譜可以依據其中幾個典型個體進行繪制，以此研討疾病IgG N-聚糖糖譜與健康個體的區別。相同狀態下的IgG N-聚糖糖譜具有重現性，致使檢測IgG N-聚糖的變化用以輔助腫瘤診斷成為可能。

2 IgG N-聚糖的檢測方法

一個好的方法學是研究和檢測IgG N-聚糖的基礎，但通常情況下，N-聚糖在血清中是低豐度的，而它們又不能像核酸一樣被擴增，使豐度提升幾個數量級以便于檢測，因而尋找更高效的提取方法和更低檢測限的檢測手段也成了研究方向[3]。近年來，隨著檢測技術的快速發展，生物質譜被大量運用于N-聚糖研究，如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜[6]、液相色譜串聯三重四極桿質譜[23]及毛細管電泳質譜[24]等，生物質譜技術因其所具有的高通量、高靈敏的特性而受到了研究者的青睞。除了質譜技術，還有一部分研究者選擇使用色譜技術對IgG N-聚糖進行分析[5]。LU等[25]則建立了一種基于凝集素和毛細管凝膠電泳的N-聚糖分析技術，可以快速地分析標本中雙天線N-聚糖，大大縮短了標本篩查所需的時間。

人體內含有多種多樣的蛋白質，如果在檢測前不對標本進行處理，人體內所含的高豐度蛋白足以掩蓋糖蛋白信息，所以在N-聚糖進樣分析前，適當地對N-聚糖進行分離和純化是十分有必要的。目前獲得高純度N-聚糖的一般流程如下：首先將IgG從血清標本中分離，此前的研究較多使用聚丙烯酰胺凝膠電泳對血清中的IgG進行分離，但目前絕大多數的研究使用一種名為蛋白A或蛋白G的細菌蛋白來分離IgG，其具有和各種IgG結合的特性，可以快速、特異地分離血清中的IgG，目前已被商品化并廣泛運用[17]。接著進行糖鏈的釋放，方法主要有肼解法和酶解法。肼解法不僅僅可以用來釋放N-聚糖，也可以用來釋放O-聚糖，這項技術所需要的條件十分苛刻，而且會導致N-乙酰葡萄糖胺殘基上的N-乙酰基基團的丟失，后續還要再進行N-乙酰化[26]。酶解法條件相對肼解法更加溫和，在進行酶切之前要對IgG進行變性處理，方便之后的酶切操作，變性手段有熱變性和化學變性2種，使用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺進行化學變性是大多數研究采用的方法[13]。酶切法所用的酶主要是胰蛋白酶[13]和PNGase F酶[26]。有研究發現，PNGase F酶在酶切N-聚糖時，不同聚糖的釋放速率有所不同，所以在應用PNGase F酶對N-聚糖進行釋放時，應適當延長反應時間，以免造成結果的偏差[27]。糖鏈釋放完成后，將對含有N-聚糖的標本進行脫鹽和富集，目前從標本中富集N-聚糖的方法主要有凝集素親和層析法、親水性層析法和氧化肼化學法等，有研究比較了這幾種方法對質譜結果的影響，發現使用氧化肼化學法提取N-聚糖標本，質譜的信號強度更高[28]。但基于色譜原理的親水性層析法由于具有安全、方便和易于商品化的特點，目前被大多數研究采用[6]。

3 IgG N-聚糖在癌癥輔助診斷中的研究進展

隨著IgG N-聚糖的檢測技術逐漸成熟、完善，有關IgG N-聚糖的改變與疾病之間的關聯的研究也逐漸深入。目前已經取得了一定成果，下面將從幾個癌癥入手，闡述IgG N-聚糖與癌癥的研究進展。

3.1肺癌 肺癌作為全世界死亡率最高的惡性腫瘤，每年造成數以百萬計的患者死亡[29]。研究人員對此進行了大量的研究，并發現了較多有價值的成果。ZHANG等[7]分離并分析了疾病特異性IgG N-聚糖，發現了幾組與肺癌相關的巖藻糖基化比值改變，可以作為區分非小細胞肺癌和良性肺部疾病的個性化生物標志物。FARKAS等[8]在他們的研究中發現具有雙天線結構并有核心巖藻糖基化和無乳糖基化的N-聚糖可以用于鑒別慢性阻塞性肺疾病和肺癌，而具有三天線結構并有巖藻糖和半乳糖基化的N-聚糖水平在肺癌患者的血清IgG中明顯升高。KOMAROMY等[9]則系統地總結了IgG N-聚糖在慢性阻塞性肺疾病和肺癌中特異的改變，主要是半乳糖基化水平明顯降低，唾液酸化和具有高度分支結構的N-聚糖水平升高。這些發現體現了IgG N-聚糖在肺癌和肺慢性疾病中有著明顯的區別，在肺癌和肺慢性疾病中的鑒別和診斷上有著不容忽視的價值。

3.2結直腸癌 結直腸癌同樣也是世界范圍內，特別是在日本和歐洲地區發病率較高的惡性腫瘤之一，并且發病率逐年上升[30]。SIMURINA等[10]研究發現，患有慢性腸部疾病比如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的患者，血清IgG Fc段的半乳糖基化水平較低。ZOU等[11]研究發現，結直腸癌患者血清IgG的N-乙酰葡糖胺水平升高，而半乳糖基化、巖藻糖基化和唾液酸化水平降低，并且選取了11個具有差異的N-聚糖建立了一套特異、高效的篩選方法用來區分結直腸癌患者和健康個體。LIU等[12]研究發現9個IgG N-聚糖在疾病組與對照組之間存在差異表達，推測核心巖藻糖基化、唾液酸化和唾液酸核心巖藻糖基化可能與結直腸癌的發生有關，并且還發現了5種不同IgG N-聚糖在不同分期的患者中存在區別。這些研究表明IgG N-聚糖在慢性腸炎與結直腸癌的鑒別、診斷及預后判斷上有著極大的潛力。

3.3胃癌 胃癌是最具侵襲性的胃腸道惡性腫瘤之一，成為中國發病率第二高的癌癥[1]。ZHANG等[13]分析了443例胃部良性疾病患者和403例胃癌患者的血清Ig，發現胃部良性疾病患者血清中疾病特異性IgG1中的5種N-聚糖和IgG2的半乳糖基化、唾液酸化性與疾病相關，且IgG2 G2FN/G1FN對胃部良性疾病和胃癌有較好的區分能力。QIN等[14]研究發現，胃癌患者在腹膜轉移前后血清IgG N-聚糖糖譜存在不同，腹膜轉移時唾液酸化和巖藻糖基化水平升高，而中性糖基化、單半乳糖基化和分支GlcNAc水平降低，表明IgG N-聚糖改變可以作為預測晚期胃癌患者是否存在腹膜轉移的可靠指標。這些發現表明IgG N-聚糖的改變有望作為胃癌早期診斷和鑒別的有力指標。

3.4其他癌癥 除了上述的幾種癌癥，也有研究人員研究了其他癌癥的IgG N-聚糖糖基化改變。GEBREHIWOT等[15]研究發現了17個復雜型IgG N-聚糖在早期(Ⅰ期和Ⅱ期)乳腺癌患者中有較高的表達和診斷潛力，這些Ig N-聚糖多為核心巖藻糖基化、多分支和唾液酸化結構。O′FLAHERTY等[16]研究發現將IgG N-聚糖與CA125相結合可以提高預測上皮性卵巢癌的靈敏度，并且建立了一套輔助診斷方法，其在早期卵巢癌的選擇性和特異性上都要優于目前用于卵巢癌的生物標志物CA125。QIN等[17]研究發現神經母細胞瘤患者血清IgG的糖基化中半乳糖基化水平明顯高于健康個體，這個發現有望為小兒神經母細胞瘤的輔助診斷提供極大的便利。

大量癌癥與IgG N-聚糖改變之間的關聯被發現，有力地體現了檢測IgG N-聚糖在特定癌癥的早期診斷、鑒別、療效觀察和預后判斷上的潛力，有望為臨床提供更多個體化檢驗的選擇，滿足患者精準診斷、精準治療的需求。

4 小 結

隨著IgG N-聚糖與癌癥關系的研究逐漸深入，已經有大量的證據表明了IgG N-聚糖改變與腫瘤的發生發展和轉歸存在密切的關聯。這些發現均提示著通過檢測人血清IgG N-聚糖的改變可以用于腫瘤患者的輔助診斷、療效觀察和預后判斷，其作為一種非侵入性、高通量的檢測項目，有利于腫瘤患者的早期篩查、早期診斷和早期治療，為腫瘤患者爭取更多的時間，也讓臨床醫生在設計治療方案時能夠有更多的選擇。隨著更多癌癥與IgG N-聚糖改變的關聯被探明、更大樣本量的分析和檢測方法的改進、完善，未來檢測IgG N-聚糖作為腫瘤輔助診斷手段將擁有更大的潛力和更廣闊的前景。