基于結(jié)構(gòu)生物學指導的SARS-CoV-2靶向藥設計篩選

劉雪晴，嚴漢池

冠狀病毒(CoV)是迄今為止被鑒定出的最大的RNA病毒，屬于冠狀病毒科，分為α、β、δ和γ冠狀病毒4個屬[1]。SARS-CoV-2是β冠狀病毒屬的新成員，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和幾種以蝙蝠作為宿主的冠狀病毒密切相關[2]。相比于SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒，SARS-CoV-2能夠?qū)崿F(xiàn)更快的人與人之間的傳播，使病例數(shù)呈指數(shù)增長[3]。2020年3月11日，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布新冠疫情全球大流行。面對如此嚴重的疫情，SARS-CoV-2靶向藥的研發(fā)顯得十分重要，也是目前科研攻關的重點和熱點。在冠狀病毒許多生命活動中可以尋找靶向位點：病毒通過膜融合進入宿主細胞、RNA復制和轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白的翻譯和水解加工、病毒組裝和釋放等。本文主要就結(jié)構(gòu)指導的SARS-CoV-2靶向藥研究進展做歸納整理。

1 目前已有結(jié)構(gòu)的靶標

A為SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8電鏡結(jié)構(gòu)(PDB ID：7btf)；B為A旋轉(zhuǎn)180°；以cartoon形式展示部分為nsp7(綠色)、nsp8(粉色)；以surface形式展示部分為nsp12,結(jié)構(gòu)域區(qū)分：Finger(藍色)、Thumb(草綠色)、Palm(紅色)、Interface(橙色)、NiRAN(黃色)圖1 SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8復合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8 complex

索非布韋是針對HCV ns5b的藥物，通過與HCV ns5b聚合酶的催化位點結(jié)合起作用[5]。有研究稱瑞德西韋可以抑制SARS-CoV-2的增殖[6]，瑞德西韋和索非布韋均為核苷酸類似物，和RNA聚合酶競爭性結(jié)合。將瑞德西韋二磷酸結(jié)合nsp12的模型與索非布韋結(jié)合ns5b對比，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 nsp12與ns5b的Apo狀態(tài)具有極高的相似性[4]。SARS-CoV-2 nsp12是重要的藥物靶標，核苷類似物具有結(jié)構(gòu)相似性，此類藥物與聚合酶結(jié)合抑制機制可以類推到其他抗病毒藥物的研發(fā)，或許可以找到抗冠狀病毒廣譜藥物。

1.2MPro做為藥物設計的靶標 SARS-CoV-2基因組由約30 000個核苷酸組成，病毒復制和轉(zhuǎn)錄需要兩個多蛋白pp1a和pp1ab。Mpro由ppla和pplb自動裂解而來，裂解而來的MPro從多個保守位點水解多蛋白，功能性多肽通過多蛋白水解釋放[7]。抑制Mpro的活性將阻止病毒復制，而且人類體內(nèi)不存在與MPro密切相關的同源物，因而可將Mpro作為藥物設計的靶標。之前有研究證明，通過抑制Michael受體可以特異性抑制多種冠狀病毒的Mpro[8-11]。N3是一種Michael受體抑制劑，CC50>133 μmol/L，它在動物模型中顯示出了對傳染性支氣管炎病毒的有效抗病毒活性。構(gòu)建SARS-CoV-2 Mpro的同源性模型與N3進行分子對接，發(fā)現(xiàn)N3可以與Mpro底物結(jié)合部位結(jié)合。動力學分析表明它是該酶的時間依賴性不可逆抑制劑[7]。

Mpro結(jié)合N3晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：6lu7)，藍色部分為Mpro，紅色部分為N3圖2 SARS-CoV-2 Mpro-N3復合物結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of the SARS-CoV-2 Mpro-N3 complex

通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法篩選出7種化合物：disulfiram、carmofur、ebselen、shikonin、tideglusib、PX-12和TDZD-8。其中ebselen對Mpro活性的抑制作用最強，IC50值為0.67 μmol/L。將ebselen和N3做進一步體外酶促抑制實驗：qRT-PCR結(jié)果表明，在SARS-CoV-2感染的Vero細胞中，ebselen和N3濃度為10 μmol/L時顯示出最強的抗病毒作用；噬斑減少試驗顯示，ebselen和N3對SARS-CoV-2顯示出抑制作用，EC50值分別為4.67 μmol/L和16.77 μmol/L；劑量反應曲線表明，它們兩者都能夠穿透細胞膜作用于靶標[7]。ebselen是一種具有抗炎、抗氧化和細胞保護特性的有機硒化合物，已經(jīng)用于治療躁郁癥等多種疾病，具有極低的細胞毒性，許多臨床試驗中已經(jīng)通過其安全性[12]。這些數(shù)據(jù)表明ebselen可能成為抗冠狀病毒的有效藥物。

1.3刺突蛋白(S蛋白) 冠狀病毒的密集糖基化刺突蛋白(S蛋白)由S1亞基、S2亞基組成，S蛋白在病毒與靶細胞融合過程中發(fā)揮非常重要的作用：S蛋白表面的S1亞基包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，負責與靶細胞受體結(jié)合，使病毒附著于細胞表面，觸發(fā)融合過程；受體結(jié)合破壞了S蛋白融合前三聚體的穩(wěn)定性，細胞蛋白酶切割S蛋白使S1亞基脫離，S2亞基過渡到穩(wěn)定的融合后構(gòu)象，驅(qū)動病毒和細胞膜融合[14]。

A B A為SARS-CoV-2 S蛋白單體不同構(gòu)象比較，藍色為“向下”構(gòu)象(PDB ID: 6vxx)，紅色為“向上”構(gòu)象(PDB ID: 6vsb)；B為SARS-CoV-2 RBD與SARS-CoV RBD“向下”構(gòu)象比較，藍色為SARS-CoV-2 RBD，紅色為SARS-CoV RBD(PDB ID: 6crz)圖3 SARS-CoV-2 S蛋白單體結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of a single protomer of SARS-CoV-2 S protein

有研究證明SARS-CoV-2和SARS-CoV的細胞受體均為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)。ACE2以約15 nmol/L的親和力與SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合，比結(jié)合SARS-CoV S蛋白的親和力高約10到20倍。SARS-CoV-2 S蛋白對ACE2的高親和力可能使SARS-CoV-2更容易在人與人之間傳播[15]。在S蛋白的S1亞基RBD與靶細胞ACE2受體結(jié)合后，S2亞基 HR1結(jié)構(gòu)域形成一個平行的三聚螺旋線圈中心，HR2結(jié)構(gòu)域以反平行的方式纏繞在一起彼此相互作用形成6個螺旋束(6-HB)融合核心，將病毒和細胞膜緊密融合在一起。將SARS-CoV-2的6-HB結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒相比，發(fā)現(xiàn)6-HB整體結(jié)構(gòu)高度保守，只是SARS-CoV-2 6-HB中HR2螺旋更長且彎曲程度更大，與HR1結(jié)合更緊密[1]。

S蛋白與人體ACE2受體的結(jié)合決定了病毒是否能入侵人體細胞，是藥物和疫苗設計的重點。有研究表明肽類化合物EK1可以干擾病毒6-HB的形成并有效抑制冠狀病毒感染。但是，SARS-CoV-2 6-HB結(jié)構(gòu)變化使其更加穩(wěn)定，可能降低EK1的抗病毒效力[1]。脂化可有效地提高融合抑制肽的抗病毒活性[16]。為了提高EK1及其衍生物的抑制活性，將膽固醇(Chol)和棕櫚酸(Palm)分別共價連接到EK1、EK1C、EK1P的C末端。實驗結(jié)果表明，C末端脂化(尤其是膽固醇修飾)可以提高抑制劑對SARS-CoV-2的融合抑制活性，其中連接膽固醇的EK1C表現(xiàn)較佳[1]，因此做進一步設計修飾。

選用不同的接頭將EK1C連接膽固醇，發(fā)現(xiàn)接頭長度對脂肽的總體活性具有顯著影響。EK1C4使用更長的5氨基酸接頭“GSGSG”，大大提高了它的抑制能力。EK1C4對SARS-CoV-2 表現(xiàn)出最強的抑制活性，IC50值為15.8 nmol/L，比EK1的抑制活性強149倍。EK1C4和SARS-CoV-2-HR1之間的結(jié)合親和力較單獨的EK1肽顯著提高，這表明膽固醇基團可能直接參與了與HR1的結(jié)合[1]。EK1C4的抑制機制和結(jié)構(gòu)還有待進一步研究。

隨著時間推移，SARS-CoV-2分離株在S蛋白殘基614產(chǎn)生了天冬氨酸(D)到甘氨酸(G)的突變，殘基614位于S1和S2亞基中間，SARS-CoV-2的S蛋白突變限制了S1結(jié)構(gòu)域的脫離，這一變化使S蛋白更加穩(wěn)定[17]。流行病學數(shù)據(jù)表明這增強了病毒的傳播，也進一步證明了S蛋白對攻克SARS-CoV-2至關重要。

2 具有研究價值的潛在藥物靶標

SARS-CoV-2共表達29個蛋白，病毒復制相關的蛋白16個，結(jié)構(gòu)蛋白4個，其余9個蛋白似乎與免疫逃逸相關；共有332個宿主蛋白與該病毒有一定結(jié)合力[18]。從這些蛋白中或許可以篩選出更多的抗病毒藥物靶點。

絲氨酸蛋白酶TMPRSS2，近期有研究證明SARS-CoV-2與ACE2受體結(jié)合進入靶細胞是通過TMPRSS2在S1/S2位點和S2′位點切割S蛋白引發(fā)的，TMPRSS2對于病毒進入靶細胞不可或缺。甲磺酸卡莫司他是TMPRSS2的抑制劑，可以顯著降低幾種冠狀病毒包括SARS-CoV-2的感染，并沒有對細胞產(chǎn)生任何明顯的毒性作用[19]。總之，甲磺酸卡莫司他可以阻止SARS-CoV-2感染肺細胞，然而具體的作用機制還有待闡明。

人類細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抗病毒蛋白可以識別病毒核酸并將其降解，而SARS-CoV-2編碼的兩個蛋白nsp10和nsp16可以偽裝病毒基因組，進行免疫逃逸[18]，也許這是SARS-CoV-2如此難對付的關鍵因素之一。針對nsp10和nsp16篩選設計靶向藥物，抑制病毒免疫逃逸，這或許也是有效治療方案。此假設需要實驗證明其可行性。

從源頭阻止病毒復制是有效抑制SARS-CoV-2的思路。在病毒進行翻譯或復制之前，需要解開纏繞的RNA鏈，nsp13則可能是解開RNA纏繞的蛋白[18]。因此，nsp13對靶向藥研發(fā)也有重要研究價值。

SARS-CoV-2表達的29個蛋白中，有一些蛋白的功能尚未確定，如何挖掘出更多潛在藥物靶標，篩選設計靶向藥物，還需借助結(jié)構(gòu)生物學手段做進一步研究。

3 總結(jié)與展望

從SARS病毒、MERS病毒到最近的SARS-CoV-2，我們經(jīng)歷了3次由冠狀病毒引起的嚴重疫情。此次新型冠狀病毒來勢洶洶，其傳播速度之快，波及地區(qū)之廣，對人類健康和全球經(jīng)濟造成了極大影響。目前全球的科學家們都在抓緊攻克SARS-CoV-2相關課題，關于SARS-CoV-2疫苗和藥物的研究是重點也是熱點。而在目前尚未有藥物面市的情況下，應對病毒的最有效方法仍然是做好防護、增強自身免疫力、及時發(fā)現(xiàn)并隔離。愿疫情能早日被控制！

利益沖突：無