新型冠狀病毒在Vero-E6細胞中的增殖特征分析

張炎華，何文祥，朱 穎，陳 煒，吳冰珊，修文瓊，陳宏彬，俞婷婷，鄢育青，吳晶晶，袁 平，張小鴻，駱 婧，翁育偉，鄭奎城

新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多型性，直徑60～140 nm。該病毒的傳播力可能要高于SARS冠狀病毒，不同研究團隊計算得到的基本再生指數(R0)有不同，大致在2～4之間[1-2]。病毒通過其表面的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶2(ACE2)結合[3]而發生吸附、穿入、脫殼、生物合成與組裝、成熟與釋放等一系列增殖過程。2019-nCoV的體外培養可在Vero-E6、Huh7及人呼吸道上皮細胞進行。為更好地了解2019-nCoV體外增殖情況，本研究利用一步增殖實驗分析病毒在Vero-E6細胞中的增殖特征，并對比了不同實驗方法下半數組織培養感染劑量(TCID50)的差異，以期為后續的研究提供一定的基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1材料來源 2019-nCoV病毒株(hCoV-19/Fujian/13/2020)由福建省疾病預防控制中心分離獲得并經全基因組測序(序列號：GISAID No. EPI-ISL-411066)[4]，毒株經Vero-E6傳代2代，毒株于接種后第6 d收獲，-80℃保存。病毒分離及TCID50測定等均在BSL-3實驗室內進行。

1.1.2試劑及儀器 Vero-E6細胞(ATCC○RCRL-1586TM)、細胞培養基Minimum Essential Medium(Gibco，Ref. No.41500-034)、胎牛血清(PANSera ES，Cat. No.2602-P130707)、核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Cat. No.52906)、熒光PCR反應體系為AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(Life Technologies，Cat. No.AM1005)以及中國疾控中心推薦的引物和探針[5]；儀器設備包括二氧化碳培養箱(Innova○Rnco-170)、細胞計數儀(Life，Countess Ⅱ FL)、倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100)、熒光PCR儀(ABI QuantStudioTMDx)等。

1.2 方 法

1.2.1病毒半數感染劑量(TCID50)的測定 將接種后第6 d(細胞已完全病變)的病毒培養液凍融1次后，離心取上清并分裝凍存。取1管凍存的病毒液按半對數稀釋法自10-2稀釋至10-7，96孔板中長滿單層的Vero-E6貼壁細胞用細胞維持液(含2%胎牛血清的MEM)洗滌2遍，加入100 μL稀釋好的病毒液，每個稀釋度重復4孔，以細胞維持液為陰性對照，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中孵育90 min，期間每30 min晃動細胞板1次。孵育完成后吸出病毒液，用細胞維持液洗滌細胞1遍后，每孔加入200 μL細胞維持液，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中孵育，每日觀察細胞病變，于接種后第6 d終止實驗，根據Reed-Muench方法計算TCID50。為比較不同實驗條件對TCID50的影響，本研究還設置了病毒凍融、病毒在貼壁細胞中吸附后是否洗滌以及不同細胞濃度懸液條件下測定TCID50的差異。

1.2.2病毒增殖及滴度測定 將病毒儲存液稀釋至5 TCID50/100 μL，取病毒液7.8 mL(根據培養容器底面積和測定TCID50時100 μL/孔的量換算)接種至T25(底面積為25 cm2)細胞培養瓶中(細胞貼壁密度在95%～100%，細胞數量約2.42×106/瓶，MOI約為1.74×10-4TCID50/cell)，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中孵育90 min，期間每30 min晃動細胞瓶1次，孵育完成后吸出病毒液，用細胞維持液洗滌細胞1遍，往細胞瓶中加入10 mL細胞維持液，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中孵育，從孵育后開始，每24 h觀察細胞病變并同時吸取0.55 mL增殖產物，離心后上清凍存于-80 ℃備用，至第6 d時終止實驗。將每日收集上清從原始濃度開始半對數稀釋至10-5，并接種至96孔細胞板，每個稀釋度3孔，每日觀察細胞病變，測定病毒TCID50。

1.2.3不同時點病毒核酸含量的測定 取50 μL每日吸取的培養上清稀釋至500 μL后取140 μL進行核酸提取，核酸洗脫量為50 μL，每個樣本重復提取核酸3次后根據中國疾控中心推薦的檢測方案進行檢測。根據該方案推薦的引物擴增N基因片段，測定擴增產物DNA的吸光度并計算其濃度。將已知濃度的擴增產物系列稀釋后作為核酸擴增模板，根據上述檢測方案測出不同核酸濃度對應的Ct值(Cycle Threshold)后繪制標準曲線，最后根據標準曲線計算每日增殖的培養上清液核酸濃度。

2 結 果

2.12019-nCoV病毒株TCID50的測定結果 根據細胞病變結果，計算出該毒株的半數感染劑量為10-3.7TCID50/100 μL。對比不同實驗條件下的TCID50可以發現：凍融會降低病毒的感染滴度，應盡量避免；細胞懸液為3×104/mL時的TCID50值低于2×105/mL時的TCID50值，但差異不大；病毒在貼壁的Vero-E6細胞中吸附90 min后吸去病毒液并洗滌1次時的TCID50值低于不吸去不洗滌時的TCID50值，但差異不大。不同實驗方法下的TCID50結果見表1。

表1 不同實驗條件對2019-nCoV TCID50測定的影響Tab.1 Effect of different test conditions on TCID50 determination of 2019-nCoV

2.2新型冠狀病毒在Vero-E6細胞中的增殖情況 將濃度為1.74×10-4TCID50/cell的病毒接種至Vero-E6細胞后，第1 d無肉眼可見的細胞病變，第2 d約有25%的細胞發生病變，第3 d有超過50%的細胞發生病變，第4 d絕大部分的細胞已發生病變。測定每日增殖產物的病毒感染滴度，根據N基因定量結果繪制標準曲線并計算上清液核酸濃度。結果顯示，2019-nCoV在Vero-E6細胞中的前48 h迅速增殖，平均復制周期約為3.29 h，核酸濃度和感染滴度在48 h左右達到峰值，之后核酸濃度維持在較高水平但感染滴度開始逐漸下降。增殖上清液的病毒滴度和核酸濃度結果見圖1和表2。

圖1 2019-nCoV在Vero-E6細胞中增殖時其感染滴度和RNA濃度的時間分布曲線Fig.1 Time distribution curve of the viral titer and RNA concentration of 2019-nCoV in Vero-E6 cells

表2 2019-nCoV在Vero-E6細胞中增殖時其感染滴度和RNA濃度的時間分布Tab.2 Time distribution of the viral titer and nucleic acid concentration of 2019-nCoV in Vero-E6 cells

3 討 論

病毒本身缺乏增殖所需的酶系統，只能在易感的活細胞內進行增殖。病毒增殖過程中的吸附、穿入、脫殼、生物合成與組裝、成熟與釋放等各個階段都影響著病毒在宿主細胞中的增殖特征。本文從病毒活性和數量相對時間變化兩個方面對2019-nCoV在Vero-E6細胞中的增殖情況進行分析，獲得了較為初步的增殖特征。

無論從病毒感染滴度還是核酸擴增結果來看，在起始MOI為1.74×10-4TCID50/cell條件下，2019-nCoV在Vero-E6細胞中的增殖情況均表現為接種后前2 d迅速增殖，并在第2 d左右達到峰值，這與SARS-CoV的增殖特征相近[6-7]。病毒感染滴度在第2 d后開始迅速下降，可能是由于細胞病變后，病毒失去寄生的宿主而無法繼續復制，加上培養條件下病毒逐漸失去活性所致。培養上清中的核酸經過快速復制后維持在較高水平，反映了病毒的數量在培養上清中維持穩定，但病毒感染活性逐步下降。從核酸水平來看，核酸濃度在0～24 h(第1 d)內大約上升了126倍，在24～48 h(第2 d)內大約上升了157倍，在48～72 h內大約上升了1.7倍。由于第0 d培養上清中的核酸濃度僅表示吸附階段未被細胞吸附且未洗滌干凈的部分，已經被細胞吸附的活病毒核酸難以估計，也就是說起始核酸濃度難以準確估計，我們以24～48 h內的核酸濃度變化來估算病毒的增殖速度。按照2n的增殖模型，我們可以計算出2019-nCoV病毒在Vero-E6細胞中的平均復制周期約為3.29 h，這比SARS-CoV在Vero-E6細胞中增殖的周期7～10 h[6，8]要短得多。

關于TCID50的測量方法，不同的病毒在不同的文獻中有差別，如腸道病毒使用2×105個/mL的細胞懸液來測量[9]，而流感病毒使用貼壁細胞來測量[10-11]。本文對不同細胞懸液濃度、病毒吸附貼壁細胞后是否洗滌以及病毒的凍融次數等條件對TCID50的影響做了初步比較，以供更多的研究者參考。本次研究表明，不同細胞懸液濃度、病毒吸附貼壁細胞后是否洗滌對測定TCID50影響不大，但用于TCID50測定的病毒液應避免反復凍融，以免影響病毒感染滴度。

本文初步分析了2019-nCoV在Vero-E6細胞中的增殖情況，研究結果仍可為病毒的分離培養、抗病毒藥物研究以及疫苗研制等工作提供一定的參考意義。

利益沖突：無