泡狀棘球蚴原頭節與肝癌細胞共培養的相互作用研究

楊海成，楊照輝，史康杰，溫鈺鵬，張示杰

泡狀棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是一種人獸共患病，當人誤食多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，E.multilocularis)的蟲卵時，蟲卵發育成六鉤蚴入血，成蟲寄生于肝臟可致AE。E.multilocularis的生命周期復雜，根據流行病學研究發現其終宿主為野生或家養犬科動物，如北極狐、豺、狼或狗等，而人類是中間宿主[1]。E.multilocularis的幼蟲期是AE的病原體，估計每年有17 400例感染，其中大多數發生在中國，多聚集在新疆、青海、西藏等地[2]。AE是一種破壞性的臨床病癥，其特征在于寄生蟲的進行性、浸潤性增殖，多似惡性腫瘤[3]。AE主要影響肝臟，若治療不及時，往往病死率極高[4]。肝臟中最常見的惡性腫瘤為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，隨著社會進入老齡化，我國HCC的患病數依然很龐大，5年轉移率和復發率均高于60%[5]。前期研究發現泡球蚴原頭節無法長時間在體外培養，直到Hemphill與Gottstein首次提出泡球蚴原頭節與飼養細胞共培養可顯著延長原頭節在體外的存活時間[6]。目前雖有原頭節與飼養細胞共培養的報道，發現Hela細胞可作為泡球蚴的飼養細胞，促進泡球蚴的生長發育，但泡球蚴原頭節與肝癌細胞(hepatoma cells，HepG2)共培養較少見。近年有關寄生蟲感染后導致宿主體內感染灶內細胞增殖的研究逐漸增多，多房棘球絳蟲[7]、枯氏錐蟲(Trypanosomacruzi)[8]、剛第弓形蟲(Toxoplasmagondii)[9]感染后，細胞內ERK信號通路被激活，促進宿主細胞增殖。體外實驗表明，泡狀棘球蚴囊液中存在多種促炎細胞因子。因此我們將人源肝癌HepG2細胞作為飼養細胞與泡球蚴原頭節共培養觀察泡球蚴原頭節的存活及成囊情況，反之再去觀察泡狀棘球蚴原頭節對飼養細胞的作用。基于此想法，我們初步分析E.multilocularis與肝癌HepG2細胞的相互作用及其機制，為包蟲病合并肝癌的臨床早期診治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1倫理聲明 本實驗所用動物均按照2017年3月1日《實驗動物管理條例》嚴格執行，并且經過石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會同意(許可證號：2015-018-01)。

1.2 材 料

1.2.1原頭節及肝癌細胞的制備 從新疆維吾爾自治區疾控中心購SPF級長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)50只(雌雄各25只)，實驗動物許可證號：SCXK(新)2017-0021，鼠齡在6～8周之間，體重(40±5)g，用于E.multilocularis的保種與傳代。新疆石河子大學第一附屬醫院實驗動物中心提供感染E.multilocularis6個月以上的長爪沙鼠(15只)，按照原頭節提取方法提取原頭節。肝癌HepG2細胞購于武漢普諾賽公司，使用含1%青鏈霉素(購于Gibco公司)及10%胎牛血清(購于Gibco公司)的DMEM培養基培養。

1.2.2主要試劑 伊紅染料、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、CCK8檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA細胞裂液等。

1.3原頭節與肝癌細胞共培養 肝癌HepG2細胞采用10%的胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養基，培養環境為5% CO2、37 ℃培養箱中，隔天換液或傳代。待肝癌細胞貼壁后，將原頭節按數量加入到培養瓶中，換液前提前收集泡狀棘球蚴原頭節。

1.4原頭節活性檢測及成囊情況 將存在飼養細胞的原頭節組與無飼養細胞的原頭節組重新換液時計時，每隔2 d取等量的原頭節數量進行活性檢測，使用伊紅染色的方法計算活性，以抗紅染原頭節計算存活量，以紅染原頭節計算死亡量，存活率=[存活量/(存活量+死亡量)]×100%。在原頭節與肝癌細胞共培養時，每隔7 d換液，每次取10 μL培養液計算成囊率，成囊率=(成囊泡數/視野下總原頭節數)×100%。

1.5CCK8法檢測HepG2細胞增殖情況 按5×105/mL密度將HepG2細胞種植在24孔板中并設置空白組比較，培養12 h后，以不同濃度(0、3 000、6 000、9 000 個/孔)的原頭節加入到肝癌細胞中，每組設置3個對照組，待共培養48 h與72 h后，將原頭節從上清中完全取出，每孔加入25 μL CCK-8試劑，避光，37 ℃條件中孵育1.5 h，使用酶標儀在450 nm吸光度時的吸光度(A)值，以此來計算細胞的增值率。增值率=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.6流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡情況 按5×105/mL密度將HepG2細胞種植在6孔板中，采用不同數量(0、3 000、6 000、9 000 個/孔)的原頭節與肝癌細胞共培養48 h后，徹底去除原頭節后，使用預冷的PBS沖洗干凈后，加入胰酶消化后收集細胞，分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后，設置對照組，避光情況下上機檢測。

1.7實時熒光定量PCR檢測HepG2細胞中caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平

使用上述方法處理后的細胞，Trizol法提取細胞中總RNA，調平后逆轉錄成cDNA，保存條件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。將所得cDNA進行實時熒光定量PCR，所用PCR引物序列見表1。擴增條件為:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環40次。使用2-△△Ct計算公式得出mRNA的表達量。

1.8Western Blot方法測定蛋白表達量 使用上述處理過的細胞加入RIPA細胞裂解液，獲取肝癌細胞中總蛋白樣品，用BCA的方法檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度后使各組濃度一致，應用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，加入一抗、二抗，化學發光得出灰度值計算目的蛋白表達量。

表1 實時熒光PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

2 結 果

2.1肝癌細胞作為飼養細胞可以促進泡球蚴原頭節的存活和提高活性 隨著肝癌HepG2細胞濃度的增加，原頭節形態以及活性有著顯著變化。實驗組與對照組相比較，原頭節形態更穩定，成活率更高，使用伊紅染色時，有飼養細胞存在的原頭節抗紅染能力越強，存活率為[(91.42±2.47)%]顯著高于無飼養細胞組[(73.10±4.68)%，t=-7.738，P<0.05]，見表2。

表2 飼養細胞與E.multilocularis共培養后E.multilocularis的存活情況Tab.2 Survival of E. multilocularis after co-culture with feeder cells

2.2肝癌細胞作為飼養細胞可以促進泡球蚴原頭節成囊 存在肝癌細胞作為飼養細胞時，原頭節成囊率[(66.72±2.02)%]顯著高于無飼養細胞組的成囊率[(30.21±2.25)%，t=11.228，P<0.01]。隨著定期更換飼養細胞時，囊泡的直徑會不斷變大。

2.3泡球蚴原頭節促進肝癌細胞增殖及抑制凋亡

2.3.1利用CCK8法檢測泡球蚴原頭節與肝癌細胞共培養48 h和72 h后肝癌細胞的增殖情況 將泡球蚴原頭節與肝癌細胞共培養48 h后，與無原頭節共培養組比較，實驗組(4.13±0.04,4.43±0.07,3.77±0.04)均促進肝癌細胞增殖(t=-130.912、-89.051、-134.067，P均<0.01)，濃度為9 000個/孔組較前兩組有所降低，但均高于對照組。將共培養時間增加到72 h時，實驗組(5.24±0.06,5.84±0.04,6.94±0.05)均高于對照組(t=-125.853、-206.432、-219.405，P均<0.01)。見圖1。

①P<0.01 vs 對照組 (0個/孔). 圖1 CCK8法檢測不同數量原頭節對肝癌HepG2細胞增殖情況Fig.1 CCK8 method for detecting the proliferation of HepG2 with different numbers of protoscolex

2.3.2Annexin V-FITC/PI 流式細胞術檢測原頭節抑制肝癌HepG2細胞凋亡情況 如圖2所示，檢測共培養48 h后的肝癌細胞凋亡情況，流式結果顯示：對照組凋亡率為(25.27±0.05)%，濃度為3 000個/孔組凋亡率為(17.28±0.10)%, 6 000個/孔組為(9.96±0.03)%, 9 000個/孔組為(18.78±0.07)%。與對照組相比，實驗組中3 000個/孔、6 000個/孔和9 000個/孔組肝癌HepG2細胞發生凋亡的比例均降低(t=18.829、31.523、11.644，P均<0.01)，但6 000個/孔組凋亡比例最低，見圖2。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖2 Annexin V-FITC/PI 流式細胞術檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況Fig.2 Annexin V-FITC/PI flow cytometry detecting HepG2 cell apoptosis

2.3.3泡球蚴原頭節與肝癌細胞共培養后肝癌細胞中mRNA的變化 與對照組相比較，實驗組中Bcl-2表達升高(F=75.801，P<0.01)，而Bax、caspase3、caspase9、P21、P53表達降低(F=70.206、360.218、240.962、687.871、182.437，P均<0.01)，但發現濃度6 000個/孔組的促凋亡基因下降不明顯，而促增殖基因反而升高明顯。見圖3。

2.3.4原頭節與肝癌細胞共培養后可降低肝癌HepG2細胞的Bax、caspase3和caspase9表達，并促進Bcl-2表達 利用Western-blot檢測不同數量原頭節對HepG2中Bax、caspase3和caspase9的表達，均呈現不同程度的降低(F=703.092、48.490、968.834，P均<0.01)，但隨著原頭節數量的不斷增加Bcl-2的表達卻增加(F=103.726，P<0.01)，見圖4。說明原頭節可通過caspase通路及線粒體通路來影響HepG2細胞的凋亡。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖3 Real-Time PCR檢測凋亡相關分子caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、P21、P53的mRNA表達情況Fig.3 Real-time PCR detection of the mRNA expression of the apoptosis-associated molecules caspase3, caspase9, Bax, Bcl-2, P21 and P53

3 討 論

泡狀棘球蚴病雖是良性病變，但呈現惡性生長，較易侵襲和轉移，故生存率較低。原發性肝癌的發生發展是一個多因素、多階段的過程，需要基因改變和表觀遺傳的共同參與。而泡狀棘球蚴的生長發育是依賴于宿主環境而呈現浸潤性生長，研究表明不同動物種屬之間的細胞因子如胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和轉化生長因子-β等不僅結構上有明顯的同源性，而且在功能上也可以相互替代[10]。因此利用這一點宿主可能提供某些細胞因子為其生長提供幫助，而動物進化及生長最早是建立在細胞間通訊的基礎之上。有研究表明EGFR通路可參與泡狀棘球蚴生發層細胞的增殖和存活，抑制EGFR通路可誘導泡球蚴生發細胞的caspase3酶活性升高，出現凋亡特征[11]。研究團隊還發現當抑制EGF所誘導的ERK磷酸化，可導致生發層細胞的凋亡，抑制其增殖[12]。泡狀棘球蚴甚至還表達G蛋白偶聯受體(GPCRs)、蛋白酶、鐵離子通道等[13]。本研究發現泡球蚴原頭節的生長發育離不開飼養細胞，當肝癌HepG2細胞與之共培養時，原頭節存在顯著的高存活率，延長了泡球蚴原頭節在體外培養的時間，且更易成囊成泡，為后期研究生發層細胞提供可靠來源。發生此現象的原因可能是肝癌HepG2細胞分泌了某些細胞因子作用于泡狀棘球蚴原頭節的對應受體導致相關通路的激活，以此來促進其生長發育。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖4 Western-blot 檢測HepG2中Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9的表達Fig.4 Western-blotting detection of the expression of Bax, Bcl-2, caspase3 and caspase9 in HepG2 cells

Romic B等[14]對肝細胞癌(HCC)合并肝包蟲病的研究進行了系統回顧，分析了HCC癌變的性質，以了解肝癌變的診斷特征并作出合適的治療。Kübeck M等[15]報告了目前肝癌合并AE的病例，闡述了泡狀棘球蚴可導致慢性肝實質性改變，以此來促進肝癌的發生。上述研究僅局限于通過臨床病例進行分析，并未有明確的分子機制來闡明發生的原因。Stadelnan B等[16]發現E.multilocularisPGI與人類的PGI在核酸序列上有86%的同源性，這種酶可作為一種生長因子在肝癌發生上起重要作用。另有研究人員發現AE可影響人類的免疫系統，以此來增加惡性腫瘤發生的風險。caspase3對于腫瘤的凋亡是一個重要分子，剪切的caspase3是促進凋亡的主要裂解酶，而Bcl-2可抑制caspase3的活性，Bax與Bcl-2同源為一種水源性相關蛋白，Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的保護作用[17]。本研究發現當原頭節存在時，CCK8檢測結果顯示共培養時肝癌細胞表現出活躍增殖現象，且流式結果與CCK8一致表現出凋亡減少，顯著低于對照組，但濃度6 000 個/孔組的凋亡率低于3 000 個/孔組與9 000 個/孔組，發生這種原因的可能是9 000 個/孔組原頭節密度較大，影響了肝癌HepG2細胞的代謝。實驗組的P21、P53、caspase3、caspase9及Bax低于對照組，Bcl-2高于對照組，隨著原頭節數量的增加，增殖呈現上升趨勢，表明無論從caspase家族或線粒體通路都是原頭節抑制肝癌細胞的凋亡而促進增殖，這說明原頭節可能分泌某些促增殖因子例如EGF、OPN等，它們作用于肝癌細胞表面受體導致此現象的出現。

本實驗是研究泡球蚴原頭節與肝癌細胞的相互作用，可為后期體外培養原頭節及生發層細胞提供依據，也可為預防泡球蚴病合并肝癌患者復發或惡化提供理論依據。研究證實了泡球蚴原頭節可促進肝癌細胞的增殖而抑制其凋亡，這可為后期研究提供理論依據以及組織損傷修復的新藥開發奠定基礎。但本研究對具體分泌了哪些因子導致該現象的產生尚無定論，機制尚未闡明。因此需要進一步探索以解釋更深的機制，也需進一步加強泡球蚴原頭節生物制劑的基礎實驗和臨床研究。

利益沖突：無