細粒棘球絳蟲水通道蛋白9的多肽特征及免疫定位研究

譚青青,李 鍇,張 靜,2,高 劍,吳宏燁,范俊杰,陸 合,2,葉 彬,2

囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)是人體與某些食草動物(如牛、羊)感染細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus, Eg)的幼蟲—棘球蚴(hydatid)所引起的一種人獸共患寄生蟲病[1]。該病呈世界性分布，嚴重危害人體健康及畜牧業發展[2-3]。原頭蚴在不同宿主體內具有雙向發育的特征，在終宿主體內發育為成蟲，在中間宿主體內逐漸長成不育的棘球蚴[4-5]。棘球蚴主要由囊壁和囊液組成：囊壁分為外層無細胞的角皮層和內層含大量生發細胞的生發層；囊內充滿無色透明或呈淡黃色的棘球蚴液[6-7]。水分子進入棘球蚴囊內可通過簡單擴散或滲透的方式，但是檢測生發細胞胞膜的通透系數發現簡單擴散的水分子通過細胞膜的通透系數遠小于滲透水的通透系數[8]，提示棘球蚴囊壁生發層細胞膜上可能存在某種通道蛋白可以通透水，從而影響棘球蚴囊液的生成，但對此結果并沒有進行深入探索研究。

水通道蛋白(Aquaporins， AQPs)，又被稱為親水孔蛋白，是主要內在蛋白(major intrinsic protein， MIP)超家族成員[9]。哺乳動物、植物、真菌、病毒、細菌、原生動物、蠕蟲中均發現了水通道蛋白的存在[10-11]，在不同組織細胞的細胞膜中水通道蛋白除了轉運水、甘油或尿素等中性小分子溶質[12-14]，還能促使CO2、氨和一些金屬鹽類如銻酸鹽、亞砷酸鹽等的滲透[15]。有研究報告表明，AQPs在寄生蟲體內發揮重要作用，可參與蟲體內營養物質的運輸、代謝產物的排出以及滲透壓的調節等生理過程，還可參與抗寄生蟲藥物轉運[16]。

水通道蛋白9(AQP9)是水通道蛋白家族的重要成員之一，屬于水-甘油通道蛋白[17]。最初在脂肪組織中發現，后來實驗證明AQP9能夠顯著加快細胞膜內水及一些中性溶質(甘油、尿素等)的轉運[18]。目前，對AQP9研究主要集中在腦部疾病、肝臟疾病、妊娠及相關疾病、眼部疾病等，在它們的生理病理過程中起著重要作用[19-24]。前期實驗中發現在細粒棘球絳蟲原頭蚴及棘球蚴囊壁中存在AQP9，并且轉錄表達量較細粒棘球蚴體內其它幾個水通道蛋白高[25]。在原頭蚴囊化為次生棘球蚴過程中，會伴隨有棘球蚴囊液的生成，由此推測細粒棘球絳蟲水通道蛋白9 (EgAQP9) 在原頭蚴囊化時產生棘球蚴液過程中可能發揮重要作用。但是在本課題組前期研究中，EgAQP9在非洲爪蟾卵母細胞中異源表達失敗，提取爪蟾卵母細胞膜也并沒有檢測到EgAQP9蛋白的表達[26]。由于不同宿主之間的密碼子偏好性存在一定差異，失敗的原因可能是非洲爪蟾卵母細胞并不是EgAQP9蛋白異源表達的最佳選擇。通過密碼子偏好性分析發現酵母表達系統可能優于爪蟾卵母細胞表達系統，但更重要的是分析表明細粒棘球蚴AQPs密碼子使用偏好性普遍較弱[27]，EgAQP9在酵母體內也不一定會成功表達。因此，本研究通過將人工合成多肽與載體蛋白偶聯作為免疫原免疫新西蘭兔以制備多克隆抗體，并加以驗證，初步了解AQP9在原頭蚴和棘球蚴細胞及組織內的具體表達位置，為后續研究EgAQP9的生物學功能和棘球蚴囊液生成機制提供分子定位工具。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1組織來源和實驗動物 感染細粒棘球蚴的羊肝來自新疆某屠宰場；4 周齡的雌性BALB/C小鼠與8 周齡的雄性新西蘭兔(SPF級)由重慶醫科大學動物實驗中心提供。

1.1.2主要試劑 馬來酰亞胺活化的鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯試劑盒(Sigm,美國)，蛋白質Marker(Solarbio，北京)，PVDF膜(Bio-Rad，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG抗體(Proteintech，美國)，Cy3羊抗兔IgG二抗(Earthox，美國)，熒光染料DAPI(碧云天，上海)， SP免疫組化試劑盒(中杉金橋，北京)。

1.2 方 法

1.2.1多肽抗原的設計、合成及鑒定 根據NCBI數據庫中搜索到的EgAQP9特異氨基酸序列，使用Immune Epitope Database (IEDB)軟件和BCPREDS軟件對EgAQP9 B細胞線性抗原表位進行預測，分析蛋白跨膜區應用在線TMHMM Server v.2.0軟件。選取其中一段具有高度抗原性的非跨膜區保守序列，交由武漢戴安生物技術有限公司合成，通過HPLC和ESI-MS檢測合成多肽的純度及分子量。

1.2.2偶聯多肽及制備免疫原 將純化后的多肽分出一部分偶聯KLH以制備免疫原，將其溶解于無菌的PBS中，然后分別與弗氏完全和不完全佐劑以等體積比例混合，進行充分乳化后作為免疫原，剩下一部分裸肽不做任何處理,用于檢測抗體特異性。

1.2.3制備與純化多肽抗體 選擇充分乳化的弗氏完全佐劑作為免疫原，每只兔注射0.5 mg多肽，采用頸背部皮下多點注射的方法免疫健康新西蘭兔。第28 d、42 d、49 d需要對新西蘭兔加強免疫，以相同的劑量和方法為新西蘭兔注射充分乳化的弗氏不完全佐劑。第3次加強免疫后的第7 d經兔耳采血、分離獲得血清。提前準備好以裸肽作為包被原包被的96孔板，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測上述獲得的血清抗體效價，采血第2 d進行第4 次加強免疫，注射7 d后再次采血分離血清，若檢測血清抗體效價符合要求，采用頸動脈放血的方式取全血，分離的血清于-20 ℃冰箱保存備用。新西蘭兔初次免疫前采集的血清作為陰性對照。抗體純化委托給武漢戴安生物技術有限公司，純化結果通過SDS-PAGE鑒定。

1.2.4測定多肽抗體效價 將合成的一部分適量裸肽稀釋成濃度為2 μg/mL的溶液，包被96孔聚丙烯反應板，加入的裸肽溶液量為100 μL/孔, 4 ℃條件下過夜，結束后用PBS配制的洗滌液充分洗板；每孔加入200 μL 5%的BSA-PBS，在37 ℃ 封閉2 h，結束后用PBS配制的洗滌液充分洗板；PBS緩沖液稀釋的抗血清作為一抗，初始稀釋比例為1∶1 000，采用倍比稀釋方式，直至稀釋到1∶256 000, 陰性對照為1∶1 000稀釋的免疫前兔血清，每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h，結束后用PBS配制的洗滌液充分洗板；每孔加入100 μL濃度為1∶10 000的二抗，37 ℃孵育1 h，結束后用PBS配制的洗滌液充分洗板。反應板洗凈后并在吸水紙上扣干，加入顯色劑TMB顯色15 min，每孔加入終止劑 50 μL 終止顯色，混勻后酶標儀上讀取450 nm處波長的OD值。

1.2.5Western blot檢測EgAQP9 取適量細粒棘球蚴加入RIPA裂解液中裂解細粒棘球蚴，冰上超聲震碎15 min，冷凍高速離心機離心后取一定量上清進行 Western blot 實驗。純化后的兔抗血清和免疫前兔血清分別作為一抗過夜孵育，結束后用PBST漂洗膜3次，再加二抗孵育2 h，結束后用PBST漂洗膜3次，洗膜完成后應用ECL顯色，在凝膠成像分析系統上讀取Western blot 結果并保存圖像。

1.2.6免疫熒光實驗分析EgAQP9的亞細胞定位 向生長良好的棘球蚴生發細胞中加入胰蛋白酶消化后終止，PBS緩沖液充分洗滌，把分散的棘球蚴生發細胞加入24孔板中，放爬片，待細胞貼壁后，用PBS清洗4 次，每次5 min；室溫固定細胞(4%多聚甲醛)30 min，PBS清洗3 次，每次3 min； 室溫下細胞透化(0.25% 的Triton X-100)10 min， PBS清洗3次，每次3 min；用免疫前兔血清在室溫條件下封閉30 min；甩走封閉液，暫不清洗，分別直接加入1∶1 000稀釋的兔多克隆抗體或兔免疫前血清作為一抗，室溫孵育1 h；接著加入用1∶1 000稀釋的二抗，室溫條件下避光孵育1.5 h；最后加入1∶1 000稀釋的熒光染料DAPI對玻片核染10 min，PBS清洗1次，封片完成后在熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.2.7免疫組化實驗檢測EgAQP9的組織定位 石蠟切片分別浸入二甲苯I、II缸中，每次10 min；稍微瀝干后，浸入由高到低濃度的乙醇中進行梯度酒精水化，去離子水沖洗切片1 min后，浸入PBS緩沖液中。將pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液(0.01 mol/L)加熱至95 ℃，小心放入組織切片加熱10 min進行抗原修復，冷卻至室溫后取出切片，PBS緩沖液沖洗切片3 次，每次3 min。加入內源性過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗切片3 次，每次3 min。加入適量的正常山羊血清，封閉10～15 min，倒去血清，暫不沖洗；依次加入適量的一抗、二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液和新鮮配制的DAB顯色液在一定條件下孵育，前3 次孵育結束后用PBS緩沖液充分清洗，最后一次孵育結束后自來水沖洗終止顯色反應，蘇木素染色液復染20 s，自來水沖洗后用1%的鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍。脫水、透明后在通風櫥中風干切片，中性樹膠封片晾干后閱片。

2 結 果

2.1B細胞線性抗原表位預測結果 將EgAQP9的氨基酸序列輸入在線IEDB軟件中，閾值點選為 -0.302時，顯示有13個B細胞線性抗原表位，其中抗原表位評分最高的一段氨基酸序列位于第284～313位氨基酸。BCPREDS軟件中通過使用AAP predictions方法獲得的7個B細胞線性抗原表位，評分最高的一段氨基酸序列位于第283～302位氨基酸；使用BCPreds predictions方法獲得的5個B細胞線性抗原表位，評分較高的一段氨基酸序列同樣是位于第283～302位氨基酸。結合這兩種軟件對EgAQP9的抗原表位評分結果，分析顯示EgAQP9中形成多肽抗原評分較高的一段氨基酸序列是位于第283～302位的氨基酸(圖1)。

A：IEDB軟件；B：AAP predictions(BCPREDS軟件)；C：BCPreds predictions(BCPREDS軟件)圖1 EgAQP9的B細胞線性抗原表位預測結果Fig.1 Line B cell prediction of EgAQP9

2.2多肽抗原的特征 EgAQP9跨膜區域結構通過在線TMHMM Server v.2.0軟件預測分析顯示有6 個跨膜區(圖2)。根據EgAQP9的抗原表位及跨膜區預測結果，多肽氨基酸序列設計為：ASEEHSTDEDEDTEA，交由武漢戴安生物技術有限公司合成。

圖2 TMHMM 軟件分析EgAQP9的跨膜區結構Fig.2 Transmembrane structure of EgAQP9 on the basis of TMHMM software

HPLC檢測合成多肽的純度(圖3)，總共出現3 個成分峰，位于中間成分峰的濃度(96.64%)顯著高于余下兩個成分峰的總濃度(3.36%)。經測定該多肽的純度為96.64%，達到了免疫純度要求(表1)。得到的主要成分峰經電噴霧質譜技術分析，合成肽的質荷比(m/z)[M+2H]2+離子峰所計算得到的實際分子量與理論分子量(1 766.69)相吻合(圖4)。

圖3 HPLC檢測多肽結果Fig.3 HPLC results for the peptide

表1 HPLC 測定多肽純度Tab.1 Determination of peptide purity with HPLC

圖4 ESI-MS分析多肽結果Fig.4 ESI-MS results for the peptide

2.3多肽抗體的純化 SDS-PAGE檢測純化的EgAQP9多肽抗體結果顯示位于25 kDa與55 kDa處的特異性條帶分別與抗體IgG輕鏈和IgG重鏈的分子量一致(圖5)，表明純化的EgAQP9多肽抗體符合要求，效果較好，可用于后續實驗。

1:蛋白marker; 2:純化后的多肽抗體圖5 純化后的EgAQP9多肽抗體結果Fig.5 Results of the purified EgAQP9 polypeptide antibody

2.4多肽抗體效價檢測及其對 EgAQP9的識別 間接ELISA檢測純化后抗體效價高達1∶256 000(圖6)，陽性判斷的依據是抗血清A450值/陰性血清A450值>2.1。將純化合格的多肽抗體用于Western blot檢測細粒棘球絳蟲體內的EgAQP9，在約36 kDa處顯示1條明顯的條帶，與EgAQP9理論分子量大小吻合(圖7)。

2.5免疫熒光實驗觀察 EgAQP9的亞細胞定位 以兔多克隆抗體或兔免疫前血清為一抗，Cy3羊抗兔IgG為二抗，應用免疫熒光技術對細粒棘球蚴生發細胞中的AQP9進行細胞定位。通過熒光顯微鏡觀察，可見生發細胞的細胞質及細胞膜中有明顯紅色熒光(圖8)，表明EgAQP9主要分布于生發細胞的細胞質及細胞膜中。

因誤差線太小而未在圖中顯示出來圖6 ELISA檢測EgAQP9多肽抗體效價 Fig.6 Antibody titer of EgAQP9 polypeptide by ELISA

1：EgAQP9多肽抗體孵育的細胞；2：與兔免疫前血清一起孵育的細胞；A：抗體的免疫熒光染色；B：DAPI染色的細胞核；C：A與B的疊加圖8 EgAQP9在棘球蚴生發細胞中的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of EgAQP9 in germinal cells of hydatid cysts

1：EgAQP9多肽抗體；2：免疫前血清；A: 細粒棘球絳蟲原頭蚴；B:鼠源繼發棘球蚴囊泡；C:羊源細粒棘球蚴囊泡圖9 EgAQP9分別在原頭蚴、鼠源繼發棘球蚴囊泡及羊源棘球蚴囊泡中的組織定位(100×) Fig.9 Histological localization of EgAQP9 in Echinococcus granulosus hydatid cyst tissues (100×)

2.6免疫組織化學實驗觀察EgAQP9的組織定位 EgAQP9在原頭蚴、鼠源繼發棘球蚴囊泡及羊源棘球蚴囊泡中組織定位的檢測采用免疫組織化學方法,將制備好的組織切片放在光學顯微鏡下觀察并采集圖片，在原頭蚴的蟲體表面可見AQP9；在鼠源及羊源繼發棘球蚴囊泡的生發層均可見AQP9(圖9)。

3 討 論

AQPs廣泛存在于各種生物體內，尤其是與水代謝密切相關的組織器官中，介導細胞膜之間跨膜物質的轉運[28]。目前，在哺乳動物體內已發現13 種AQPs，其中AQP3、7、9、10屬于水-甘油通道蛋白，因為它們不僅能轉運水，還能通透甘油、尿素等小分子溶質，因此在維持機體液體轉運和代謝平衡中起重要作用[29-30]。經研究表明，AQP9表達水平的改變與妊娠、肝臟疾病、眼部疾病及腦損傷等都密切相關，在病理情況下，都會有相應的表達增強[19-24]。

目前，寄生蟲體內生物膜上的AQPs已有定位研究[31-33]，但在細粒棘球絳蟲體內的定位研究卻處于空白狀態。前期實驗中，本課題組在原頭蚴及繼發棘球蚴囊壁中成功克隆出AQP9，并且qPCR結果顯示在原頭蚴中轉錄表達量最高[25]，在原頭蚴囊化形成次生棘球蚴過程中，囊內的液體也在不斷增加。因此有理由推測EgAQP9可能在原頭蚴囊化形成棘球蚴囊泡時，對囊液的生成發揮關鍵作用。

本試驗所研究的 EgAQP9基因是細粒棘球絳蟲體內的一個水-甘油通道蛋白，目前對其定位與生物學功能研究暫無報道。為研究EgAQP9的功能，抗體制備必不可少。本研究通過相關在線軟件預測并加以分析了 EgAQP9的B細胞線性抗原表位與結構特征，選擇具有高抗原性、構象穩定的B細胞線性表位且三維結構保守的非跨膜片段。在本研究之前，通過B細胞線性抗原表位預測制備的多抗已成功用于弓形蟲、藍氏賈第鞭毛蟲等基因的定位研究，鐘亮尹等[34]應用人工合成的弓形蟲CDPK5基因多肽免疫新西蘭兔，成功制備多肽抗體，定位研究發現該蛋白位于細胞質中；張佳鳳等[33]成功制備了抗弓形蟲AQPs的特異性多肽抗體，Western blot結果顯示制備的多肽能識別弓形蟲體內的AQPs，免疫熒光定位研究顯示AQPs定位于弓形蟲胞質中；馮憲敏等[35]合成了藍氏賈第鞭毛蟲磷酸烯醇式丙酮酸雙激酶(PPDK)多肽抗體，免疫熒光定位顯示位于蟲體滋養體細胞胞漿內。

制備多克隆抗體免疫原有兩種常用方法：一種是通過基因工程方法來獲取目的蛋白，將其純化并檢測效價，符合要求后作為抗原來免疫動物，但是過程繁瑣；另一種是把容易獲得的天然蛋白當作抗原來免疫動物，但是其提取純化的步驟相當復雜[36]。本研究采用人工合成多肽制備多抗，同上述兩種方法相比有以下優點：節約成本，操作簡單，應用范圍廣，還可避免雜菌污染，最關鍵的是可獲得特異性較強的抗原且所用時間較短，為后續抗體的成功制備提供了一定保障。然而人工合成多肽時，通常選擇的B細胞抗原表位多肽分子量較小，致使其免疫原性較弱，導致機體有時難以引起抗原抗體免疫反應，利用載體蛋白偶聯多肽，可以顯著增強機體內的抗原抗體反應[37]。HPLC分析結果顯示3個成分峰中的主要成分峰的含量為96.64%，表明合成的多肽純度較高。通過質譜技術分析合成的EgAQP9多肽，結果顯示主成分峰所計算得到的實際分子量與理論分子量(1 766.69)基本一致，說明多肽序列的準確性從分子量角度得到了驗證，可以用作目的免疫原，用于后續實驗中多肽抗體的制備。注射免疫新西蘭兔，測得兔血清中多肽抗體效價高達1∶256 000，表明制備的多肽抗體敏感性較好。Western blot可檢測到細粒棘球絳蟲體內的AQP9，特異性條帶出現在大約36 kDa處，通過在線軟件預測的EgAQP9理論分子量為35.17 kDa，兩者基本相符。免疫熒光試驗證實EgAQP9主要分布在原頭蚴及棘球蚴的細胞質和細胞膜中，細胞核中未見，此結果與生物信息學在線軟件預測結果一致[38]。免疫組織化學方法證實在原頭蚴中該蛋白主要分布于蟲體表面，在鼠源繼發棘球蚴囊泡及羊源棘球蚴囊泡中該蛋白主要分布于囊泡生發層，為下一步研究細粒棘球絳蟲原頭蚴成囊過程中EgAQP9與囊液生成關系提供了依據。

總之，本研究成功制備了兔抗EgAQP9多克隆抗體，利用該抗體進行了棘球蚴體內AQP9定位觀察，結果顯示該抗體能夠與其抗原特異性結合。研究結果提示該抗體還可應用于針對該分子的免疫印跡、免疫熒光及免疫組化實驗，為深入研究EgAQP9的生物學功能奠定了基礎。

利益沖突：無