宮頸脫落細胞中人乳頭瘤病毒52型感染及整合狀態分析

馬 迪，張 放，苗智穎，王 靜，徐 媛，楊佳寧，李淑英，鄭春陽

宮頸癌是全球女性第4大常見惡性腫瘤，全世界每年新增宮頸癌病例約57萬，死亡病例每年近31萬[1]，我國宮頸癌患者數量占全球總數的 1/3。宮頸癌嚴重威脅了女性的健康和生命安全[2-4]。人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是女性宮頸病變的重要病因[5]。HPV E6/E7基因整合狀態與宮頸癌變的程度密切相關，即HPV E6/E7基因整合率越高，宮頸癌變程度越高[6-7]。為進一步了解就診女性人乳頭瘤病毒感染狀況，本文對華北理工大學附屬醫院婦科就診女性的宮頸脫落細胞標本中HPV52感染及整合狀況進行了分析，探討HPV在宮頸病變中的作用機制，為宮頸病變患者的早期診斷和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1標本收集 收集2016年1月至2018年3月華北理工大學附屬醫院婦科就診女性的宮頸脫落細胞標本928例，就診女性年齡范圍在27～71歲，平均(43.5±5.0)歲，所有被檢者檢測前均未注射過HPV疫苗。標本收集過程如下：①以擴陰器暴露宮頸，用無菌生理鹽水清洗取樣部位；②用無菌棉簽在被檢者宮頸內按照順時針方向旋轉3 圈收集宮頸脫落細胞；③取出棉簽，用無菌生理鹽水洗脫棉簽中宮頸脫落細胞；④將所收集標本分成2 份：1 份迅速凍存于-80 ℃，留作DNA提取并進行HPV感染及整合狀況的檢測，另1 份用于病理組織學診斷。實驗中所用HPV52(含有HPV52基因組)質粒、β-actin質粒及293細胞DNA本實驗室保存。

1.2病理細胞學診斷 將所收集宮頸脫落細胞進行洗滌后制片、染色，用光學顯微鏡鏡檢觀察，記錄結果，參照TBS(the 2001 Bethesda system)分級系統，對所收集標本進行病理細胞學診斷。

1.3引物設計及合成 根據GenBank提供的基因序列X74481.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X74481)。HPV整合時，E2中心區域“絞鏈區”因其不穩定性而成為HPV整合入宿主細胞最常見的HPV缺失或斷裂部位，而E6和E7 ORF及長控區(long control region，LCR)保持完整[8]。依據上述原理在設計HPV52 E6引物時，選擇HPV52 E6區域的1個位點及HPV52 E2區域的3個不同部位(即HPV52 E2起始區2 735-2 910、“絞鏈區”3 261-3 395、接近終點區3 604-3 848)設計引物，這樣設計的引物可真實地反映HPV52的缺失或斷裂部位，從而可真實地反映整合狀態，設計HPV52 E6與E2引物，同時設計人看家基因β-actin引物，并合成HPV L1區通用引物MY09/11[9]，詳見表1。所有引物委托上海生工合成。

表1 實驗中所需各種引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.4DNA的提取與標本質量檢測 用試劑盒QIAamp DNA Mini Kit提取標本DNA，按說明書操作。所提標本DNA于-20℃保存備用。用人看家基因β-actin作內參PCR擴增，檢測所收集928例標本DNA質量能否滿足進一步實驗要求：用所提293細胞DNA作為陽性對照的模板，以無菌雙蒸水作為陰性對照的模板進行PCR擴增。PCR應用2×Power Taq PCR Master Mix，應用表1中β-actin引物，以所提標本DNA 0.3 μL作為反應的模板，最后添加無菌雙蒸水至總體積為20 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共33個循環；延伸72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。所得PCR產物用1%瓊脂糖進行凝膠電泳，然后凝膠成像儀照相記錄結果。

1.5標本HPV總感染率和HPV52型檢測 以HPV L1區MY09/11引物[9]檢測收集標本中HPV感染率(以HPV52質粒DNA為陽性對照的模板，以無菌雙蒸水為陰性對照的模板)；以HPV52 E6型特異性引物檢測HPV52型(以HPV52質粒DNA為陽性對照的模板，以無菌雙蒸水為陰性對照的模板)，PCR應用2×Power Taq PCR Master Mix，以所提標本DNA 0.3 μL作為反應的模板，最后添加無菌雙蒸水至總體積為0.5 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共33個循環；延伸72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。所得PCR產物用1%瓊脂糖進行凝膠電泳，然后凝膠成像儀照相記錄結果。

1.6實時熒光定量PCR 分別將HPV52及β-actin質粒進行10倍稀釋成6個梯度，以此6個梯度的質粒作為標準品，用表1(HPV52 E2、E6及β-actin)引物進行實時熒光定量PCR，每份標本用每套引物平行分析3次，以3次結果的平均值為最終結果。PCR總體積(25 μL)：1×Buffer(AmpliTaq Gold ，MgCl2free)，2 pmol/L引物，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs， 0.25 μL Rx(穩定劑)，1.25 μL 20×EvaGreen，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，將6個稀釋梯度標準品和每例樣品DNA分別加入每個PCR反應管中，加入模板DNA的量分別為0.5 μL，加無菌雙蒸水補足至25 μL。病毒載量=(E6 copy/β-actin copy) × 2，所得結果為每個細胞中HPV52拷貝數；通過E2/E6拷貝數比值，確定HPV52整合狀態。

1.7統計學分析 將所得數據建立Excel數據庫，用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義；相關性分析采用Spearman相關分析法，P<0.05為二者有相關性。

2 結 果

2.1病理細胞學診斷結果 參照2001年Bethesda分級系統，將所收集標本進行病理細胞學診斷后結果為：鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)標本9例；高度鱗狀上皮內病變(high-grade squmous intraepithelial lesion,HSIL)，包括CINⅡ及Ⅲ標本37例；低度鱗狀上皮內病變(low-grade squmous intraepithelial lesion,LSIL)，包括CINⅠ標本91例；不能排除高級別鱗狀上皮內病變的非典型鱗狀上皮細胞(Atypical squamous cells-cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)標本128例；不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASC-US)標本131例；未見上皮內細胞病變(negative for intraepithelial lesion or malignant lesions,NILM)標本532例，詳見表2。

2.2所收集標本質量檢測結果 以所收集的928例標本DNA為模板，用β-actin引物進行PCR擴增，檢測所提標本DNA質量，凝膠成像儀觀察PCR產物，結果顯示：陽性對照293細胞DNA模板PCR擴增后產物大小為289 bp，所提928例標本DNA中，每份標本 PCR擴增產物大小均為289 bp，表明所有標本DNA擴增產物大小與陽性對照結果相一致，以其中9例標本擴增結果為代表(圖1)，證實所收集928例標本質量符合實驗需求。

M：100 bp ladder；Neg：陰性對照；293：陽性對照；1-9：標本代表圖1 用β-actin引物PCR擴增檢測標本質量Fig.1 Sample quality detected by PCR with β-actin primers

2.3標本HPV檢測 所收集標本，經PCR擴增，在含0.01% 核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀照相檢測，結果顯示：以MY09/11為引物擴增，陽性對照HPV52質粒DNA模板擴增產物大小為450 bp，與陽性對照相比較，928例標本中有219例HPV陽性，以其中9例標本擴增結果為代表(圖2)。標本DNA經HPV52 E6引物(表1)擴增后，陽性對照擴增產物大小為369 bp，219例陽性標本中檢測到26例HPV52陽性，以其中9例標本擴增結果為代表(圖3)。

2.4HPV52陽性標本病毒載量的檢測 依據6個梯度10倍稀釋β-actin、E2、E6標準DNA，在實時熒光定量PCR儀擴增后，系統自動獲得E2、E6、β-actin的標準曲線，每例標本E2、E6、β-actin拷貝數自動讀出。HPV52陽性標本病毒載量可依據公式(E6 copy/β-actin copy)×2計算得出(表2)。Spearman相關分析顯示：患者宮頸病變程度與HPV52病毒載量之間無相關性(rs=0.184，P=0.568)。

依據E2與E6比值，確定HPV52整合狀態。通過計算得知26例HPV52陽性標本中，純游離型標本5例，其E2與E6比值等于1；14例為游離與整合的混合型，其0

M：100 bp ladder；Neg：陰性對照；HPV52：陽性對照；1-9：標本代表圖2 以MY09/11引物PCR擴增檢測HPV感染情況Fig.2 HPV infection detected by PCR with MY09/11 primers

M：100 bp ladder； Neg：陰性對照；HPV52：陽性對照；1-9：標本代表圖3 用HPV52 E6引物PCR擴增檢測HPV52感染情況Fig.3 HPV52 infection detected by PCR with HPV52 E6 primers

表2 病理細胞學診斷、HPV52病毒載量及整合狀態的相關信息Tab.2 Information on pathologic cytological diagnosis, HPV52 viral load and integration

3 討 論

高危型HPV52感染是引起宮頸癌、肛門癌和口咽癌的重要因素[10-11]。Klopfer等研究結果顯示：病毒載量和病毒整合狀態與臨床病理細胞學類型存在顯著相關性，并將病毒載量推薦為癌前病變的生物學標志物[12-13]。Mincheva等定量分析了宮頸癌細胞系CaSki、 SiHa和HeLa中病毒載量，結果顯示： CaSki和SiHa細胞系的每個細胞中HPV16病毒載量分別為520和1～2個拷貝；HeLa細胞系中HPV18的病毒載量為每個細胞中10～50拷貝[14]。因此，沒有一致的證據表明病毒載量是HPV相關疾病及疾病進展的標記。本項研究結果顯示，宮頸病變程度與病毒載量之間無相關性，今后將擴大標本量進一步研究相關內容。

病毒基因整合可能是由HPV E6/E7基因下游的E1與E2區域的開放閱讀框斷裂或缺失引起的；而整合的病毒基因與宿主基因相互作用[15-17]，導致病變的發生。本研究從928例宮頸脫落細胞樣本中檢測到26例HPV52陽性，陽性率為2.8%，其中5例為純游離型，即E2與E6 比值等于1；14例為整合與游離的混合型，即E2/E6比值在0與1之間；7例為純整合型，即E2/E6比值等于零。HPV 52基因整合入宿主基因組是宮頸病變的關鍵，可以通過檢測HPV 52高危型的病毒載量值進行宮頸病變的早期篩查，以便及早發現宮頸病變的高危患者。今后將進一步擴大標本量進行驗證。

利益沖突：無