脊髓損傷相關信號通路在脊髓損傷修復過程中的研究進展

敬 聰 王志剛 王 君 丁向前 鄒楊鴻 余化霖 耿 鑫

1.昆明醫科大學研究生院，云南昆明 650500；2.昆明醫科大學第一附屬醫院神經外二科，云南昆明 650500

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重的中樞神經系統疾病。據統計，大約90%的SCI 是由交通事故、暴力、體育運動或跌倒等事件引起，以頸椎損傷最為常見，其中60%的SCI 患者年齡僅在15～35 歲。SCI 臨床結局取決于損傷的嚴重程度和位置，由于SCI 后軸突不會自發再生，往往會導致嚴重并發癥，最嚴重會導致截癱[1]。SCI 是一個多種途徑、因素參與的復雜病理生理過程，不僅是原發性一次損傷及剪切、穿透或壓縮對脆弱神經組織產生的破壞，隨之而來的水腫、脂質氧化、炎癥、細胞毒性和微膠質活化等還可誘發二次損傷，導致少突膠質細胞死亡和產生軸突脫髓鞘[2]。SCI 發生初期，大量炎癥反應產生，最具特征性的改變是白細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞反應，這些反應會誘發神經膠質瘢痕形成及髓鞘源性抑制因子（myelin-associated inhibitory factors，MAIFs）產生。神經膠質瘢痕雖然有利于控制炎癥和減少進一步損傷，但會導致軸突生長錐塌陷，從而阻礙神經元重建與修復。MAIFs 在中樞神經系統損傷部位周圍膠質瘢痕中高度表達，抑制受損部位少突膠質細胞向神經元分化，使軸突再生減少，從而影響受損神經的修復。目前SCI 主要治療方法都圍繞在受壓脊髓減壓、激素沖擊治療、康復鍛煉及營養神經藥物對癥支持治療[3]，具有一定的效果，但卻沒有在根本上解決SCI 修復的病理生理過程。隨著對本病深入研究，發現神經干細胞（neural stem cell，NSC）在各種信號通路的作用下可以定向增殖與分化，尤其是軸突生長、神經束再生、少突膠質細胞誘導的髓鞘形成，這些發現為SCI 的修復提供了重要依據[4]。本文對SCI 相關信號通路在SCI 修復過程中的研究成果和進展作一綜述，希望可以為SCI 的治療開辟新的視野。

1 Wnt 信號通路

1.1 Wnt 信號通路的來源

Wingless 基因最早在黑尾果蠅中被發現，其在果蠅胚胎發育中有重要作用，缺失會導致果蠅無翅畸形。研究者[5]發現一個整合位點（integration，Int），將小鼠乳腺腫瘤病毒插入其中，可導致乳腺癌形成，將其命名為Int-1。Nusse 等[6]從多個物種的基因組DNA 與Int-1 低位雜交顯示這些基因從黑尾果蠅到人類都表現為高度保守，能夠控制中樞神經系統發育與成熟。Wingless 和Int-1 具有同源性，為了方便表示屬于這一系列的基因，于是將“wingless”和“integration”兩詞合并為Wnt。迄今為止，已發現Wnt 家族的信號分子具有19 種Wnt[7]（分別是Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-4 等）和14 種已知受體[8][10 種Frizzleds（Fzds），Ryk，Ror1/2 和PTK7]。

1.2 Wnt 信號通路的機制

Wnt 信號通路參與調節體內多種功能，尤其在蛋白質合成的關鍵過程。在中樞神經系統中，Wnt 信號通路參與神經元分化、生成、存活、死亡、再生及突觸形成、延伸、重塑等過程。Wnt 信號通路分為兩類[9]，第一類是Wnt/β-catenin 信號通路；第二類是Wnt/Ca2+和Wnt/PCP 信號通路。Wnt/β-catenin 信號通路的激活從Wnt 配體與Fzd 受體的結合開始，隨后Wnt-Fz募集支架蛋白質DVL，產生一系列蛋白結構變化[10]。同時，axin、腺瘤病大腸桿菌蛋白和GSK-3β 磷酸化后與β-catenin 結合增加，使β-catenin 進入細胞核內，與T 細胞因子/淋巴增強因子相互作用，導致Wnt 目標基因開始轉錄過程，促進神經再生。在Wnt/Ca2+途徑中[11]，主要是DVL 信號產生后，通過一系列的信號轉導、調節，使細胞內Ca2+濃度升高，從而促進對應蛋白激酶激活。在Wnt/PCP 途徑中[12]，DVL 的Wnt-Fz 結合體依賴性募集會激活小GTPase 蛋白，例如Rho 和Rac，隨后會激活Jun-N 端激酶，后者又可以轉位至細胞核或修飾細胞骨架的穩定性。

1.3 Wnt 信號通路與SCI 修復

Wnt 信號通路具有刺激神經生長、發育的作用，尤其是胚胎時期的神經系統發育[13]。Strand 等[14]發現Wnt/β-catenin 信號是幼年斑馬魚脊髓再生所必須的，隨后證實其在成年斑馬魚的脊髓再生過程中也高度表達。Wnt 具有維持人類胚胎干細胞多能性及誘導多能干細胞產生的作用，同時會促進SCI 受損處NSC向神經元分化，改善損傷處的傳導功能。李秋玲[15]發現，Wnt-3a 可以通過β-catenin 通路對脊髓神經細胞的分化起到調節作用，同時Wnt-3a 的表達會影響脊髓聯合纖維的生成。研究證實，利用Wnt 促進胚胎干細胞分化成少突膠質細胞，并將其移植到已形成神經膠質瘢痕的SCI 大鼠模型中，發現損傷處的髓鞘再生，大鼠運動功能得到改善[16]。LINGO-1 可以與NgR/P75 結合形成復合體，該結合體的表達會促進MAIFs 的表達，抑制軸突再生，產生髓鞘化。許剛等[17]研究表明，降低LINGO-1 的表達，使Wnt-7b 的表達升高，可以促進脊髓源性NSC 的增殖增加。Li 等[18]研究利用Wnt-4修飾的NSC 移植可恢復SCI 大鼠后肢運動功能。

2 Notch 信號通路

2.1 Notch 信號通路的來源

Notch 基因在突變的果蠅中發現，是一種膜受體，廣泛存在于不同生物體中，主要用于調節細胞增殖、分化、發育及凋亡等，尤其是在組織及器官的早期發育中起到重要作用。Notch 信號通路主要由Notch 受體、Notch配體蛋白、細胞內效應器分子三部分組成。Notch 受體是在各種生物組織中廣泛表達，尤其是細胞發育過程中。而Notch 配體則在不同物種中表達不一，如在果蠅中表達Delta、Serrate，而在線蟲中表達LAG-2 和APX-1。

2.2 Notch 信號通路的機制

Notch 在各物種之間高度保守，是神經發育的核心，決定NSC 增殖和神經元分化的時間及其持續時間[19]，而且不同的刺激強度會誘導Notch 信號通路激活不同的路徑和動態機制。在Notch 信號表達中，來自相同細胞型的受體和配體會產生旁抑制效應，而不同細胞群受體和配體產生誘導效應。旁抑制效應是一種正反饋的機制，這種機制在細胞發育過程中會促使細胞向不同方向分化，尤其是NSC 分化[20]。細胞膜表面的Notch 分子與Delta 配體存在的相互抑制作用屬于旁抑制效應。誘導效應分為ADAM（S2 裂解）和g-分泌酶（S3 裂解）介導的兩個連續裂解步驟，導致Notch 胞內段亞基釋放，在細胞核內與轉錄因子CSL 結合成復合體[21]，激活MAIFs 的目的基因，抑制神經元再生。

2.3 Notch 信號通路與SCI 修復

Notch 信號是控制NSC 增殖、分化的關鍵機制之一。Notch1 缺陷使NSC 提前退出細胞周期，以犧牲膠質細胞生成為代價開始神經發生，提示Noch1 在調節胚胎NSC 神經元分化的發生中起著重要作用。Zhou等[22]在體外模擬SCI 微環境中證實脊髓提取物可以通過Notch1 和Hes1 促進內源性NSC 大量增殖。Notch 信號通路在脊髓源性NSC 分化成神經元或膠質細胞中起到決定性作用[23]。同時，SCI 發生后，Notch信號表達的增強使得促神經膠質細胞分化的信號變得十分活躍，從而加速促進NSC 向膠質細胞的分化，且該過程呈不可逆趨勢。轉錄激活因子5（activating transcription factor 5，ATF5）在NSC 的增殖、分化中扮演重要作用，秦杰等[24]首次證實利用DAPT 抑制NSC中Notch 信號的表達會引起NSC 中ATF5 上調，使NSC 分化成神經元。Li 等[18]研究證明，Notch 信號配體Jagged 的負效應可以被Wnt-4 抑制，從而促進NSC 向神經元分化。

3 TGF-β/Smads 信號通路

3.1 TGF-β/Smads 信號通路的來源

TGF-β 具有多種生物學活性，與創傷的修復密切相關。TGF-β 家族由TGF-β 異構體、抑制素、活化素、骨形態發生蛋白、生長分化因子等30 多個因子組成，參與調節胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種反應，并在胚胎發育、組織分化中起到重要作用。TGF-β 有3 個亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其在體內的各種生物學活性卻不同。

1995 年，Sekelsky 等[25]先后證實果蠅的dpp 基因編碼的Smad4 類同源蛋白（mothers against decapen taplegic，Mad）是一類新的高度保守的蛋白家族，而Mad 參與TGF-β 家族的信號調節，并在多種細胞信號轉導中扮演中心角色。1996 年，Savage 等[26]在研究TGF-β 信號通路中發現，秀麗隱桿線蟲胞漿內Sma2、Sma3、Sma4 蛋白為TGF-β 樣受體下游轉導蛋白，參與信號調節的傳導，并證實其和Mad 蛋白在TGF-β 信號通路中作用與功能相似。

3.2 TGF-β/Smads 信號通路的機制

TGF-β/Smads 信號通路的主要成員有TGF-β、TGF-β 受體、各種Smads 蛋白及其核內連接蛋白[27]。TGF-β 受體本身具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化的結構域。其主要信號傳導途徑如下：當TGF-β 受體Ⅰ型、Ⅱ型被激活時，促使Smad2 和Smad3 蛋白激活，使其發生磷酸化，然后形成復合體進入細胞核內，與對應蛋白質相互結合后產生生物活性調節基因轉錄，對神經細胞分化產生影響。當Ⅰ型受體被激活時，Smad6和Smad7 蛋白與其結合后會抑制R-Smads 的磷酸化過程，導致TGF-β 信號通路的減弱甚至被阻斷。

3.3 TGF-β/Smads 信號通路與SCI 修復

TGF-β1 由體內大部分細胞合成分泌，在組織損傷時上調，通過刺激新的基質蛋白生成，誘導細胞外基質沉積，減少炎癥反應，參與損傷組織的修復，SCI后2 d 就可檢測到TGF-β1 急劇升高[28]，而TGF-β2與TGF-β3 出現的時間則較晚，其主要作用是使膠質瘢痕形成減少和小膠質細胞及巨噬細胞活化增強[29]。O’brien 等[30]研究表明，在大鼠SCI 模型中，星形膠質細胞與TGF-β 的表達增加呈正相關，后續發現TGF-β/Smads 信號通路與SCI 的炎癥反應和瘢痕形成密切相關。Kugler 等[31]的研究證實大鼠SCI 模型給予TGF-β治療后5 d，其后肢運動功能恢復較對照組效果明顯，但后續研究發現膠質瘢痕增生較對照組更多。

4 mTOR 信號通路

4.1 mTOR 信號通路的來源

mTOR 信號通路在哺乳動物中的靶點是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3 激酶相關蛋白激酶家族，在細胞代謝、增殖、分化和凋亡方面起到關鍵作用，并參與轉錄、mRNA 翻譯、自噬等生理過程。mTOR 信號通路也涉及神經發育、通路形成、突觸可塑性、學習和記憶過程[32]。在哺乳動物細胞內，mTOR分為mTORC1 和mTORC2，mTORC1 對雷帕霉素的作用敏感，而mTORC2 對雷帕霉素具有抗藥性。mTORC1在抑制自噬的同時，對蛋白質合成、核糖體生物生成和脂肪生成中起到積極的調節作用，促進細胞生長和調節細胞代謝，而mTORC2 則控制細胞生存、增殖[32]。

4.2 mTOR 信號通路的機制

mTOR 可對細胞外多種刺激產生應答，如生長因子、胰島素、營養素、氨基酸、葡萄糖等，主要通過經典的PI3K/Akt/mTOR 途徑來實現，而PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活涉及膠質瘢痕形成。結節性腦硬化復合物（tuberous sclerosis complex，TSC）是由TSC-1、TSC-2和TBC1D7 形成三聚體復合物，該復合物是Rheb 的抑制劑，而Rheb 是mTOR 活化所必需的，因此TSC 是mTOR 關鍵負調控因子[33]。在NSC 中，mTORC1 的過度激活與TSC 低表達有關，而Akt 的活化可抑制TSC的形成，從而激活mTOR 信號通路，同時mTORC1 以通過抑制PI3K 信號和mTORC1 的激活來自我調節并形成負反饋回路。

4.3 mTOR 信號通路與SCI 修復

mTOR 信號對于控制干細胞增殖和分化至關重要。Ryskalin 等[34]研究表明，mTORC1 信號改變可導致NSC 的增殖增強，但不會促進NSC 分化。mTOR 信號通路在SCI 不同時間段中發揮的作用也不相同。小鼠急性SCI 模型中抑制mTOR 能夠促進自噬，顯著減少損傷處神經元和神經細胞死亡，抑制mTOR 會降低小神經膠質細胞因子誘導的促炎癥因子的表達水平。在亞急性/慢性SCI 模型中，利用Rapa 抑制mTOR 通路，可以抑制SCI 后新蛋白的合成和減低星形膠質細胞的增殖，進而達到促進軸突再生和髓鞘的形成，最終促進SCI 修復。

5 結語

目前針對SCI 的治療研究主要是兩個方向：一是通過NSC 移植，使其分化成神經元來治療；二是通過各種刺激，促使現有神經元再生和增殖，進而達到治療目的。無論哪一種方法都與信號通路密切相關，但對于移植NSC 來治療SCI 這種方法還存在著很多不可忽視的問題，最核心原因還是內源性NSC 不足，而利用胚胎干細胞又會引起倫理道德問題。而且，體外長時間人工培養擴增NSC 的生物安全性也遭到質疑。

調節信號通路來修復SCI 現在已成為前沿的研究課題，但其具體作用及機制尚未研究透徹，尤其是信號通路如何調控SCI 的修復，所以有廣闊的研究空間及前景，需要更加深入了解信號通路與SCI 的相關分子機制，為SCI 的臨床治療提供更加有意義的參考價值。