濕熱證急性痛風性關節炎動物模型的建立與評價

★甘斌 李華南 章曉云 吳劍鋒 陳丁鵬 李松

（1.江西中醫藥大學臨床醫學院 南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

痛風性關節炎（GA）是一種由持續高水平血尿酸誘導關節及周圍組織內單鈉尿酸鹽（MSU）晶體沉積而觸發的非感染性自身炎癥性疾病［1］。GA合并癥累及廣泛，如心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等［2-3］。數據統計顯示西方發達國家在20年間GA發生率增加了一倍以上，我國GA的發生率總體也呈上升趨勢，且趨于年輕化［4］。目前國外西醫治療GA主要采用秋水仙堿、非甾體抗炎藥、皮質內固醇等對癥治療，這些治療方式短時間內便見效但普遍存在胃腸道和腎臟毒性等副作用［5］。中藥用于治療GA歷史悠久，且資源豐富，不但能夠緩解癥狀還可兼顧保護肝腎功能［6］。現代中醫傾向于將“證候”與“病”模型相結合構建病證結合動物模型，同時病證結合動物模型也是深入研究GA病理生理機制及評價中藥藥效的重要模式。筆者查閱近年國內外相關文獻, 對目前較為成熟的濕熱證和GA造模方式進行分類敘述, 闡述目前常用的模型評價標準, 為篩選穩定且具備可重復性及經濟效益高的病證結合模型提供科學依據。

1 痛風性關節炎的發病機制

1.1 現代醫學對GA的認識 GA被冠為疼痛之首，其痛來去如風是一種自限性疾病［7］。根據臨床表現大致分為4個階段：即無癥狀性高尿酸血癥期、急性發作期、臨界期以及慢性GA和痛風石（tophi）期［8］。急性發作期是GA最主要的臨床表現，炎性急性發作也是患者就醫時最迫切需要解決的癥狀，嚴重影響了患者的生活質量。急性GA發作的病理機制是MSU晶體通過膜受體被先天免疫系統識別為異物，誘導產生多種炎癥趨化因子和活化因子，最終導致大量激活了先天和后天免疫系統［9］。另有研究表明當嗜中性粒細胞在關節組織中聚集、浸潤及活化吞噬MSU晶體后，MSU晶體會隨細胞膜的溶解而釋放，危險信號將持續存在，進一步加劇炎癥反應，最終出現急性GA典型癥狀［10-11］。此外急性GA反復發作最終導致Tophi的形成并發展為慢性GA。Tophi是由纖維血管殼和更深層的蛋白質電暈組成的有組織的結構，由先天和獲得性免疫系統的細胞和MSU晶體核組成［12］。隨著Tophi的發展，尿酸鹽逐漸沉積，引發關節及組織不斷被破壞進而導致嚴重的功能喪失，大大降低患者的生活質量。

1.2 中醫學對GA的認識 古代醫家對GA的病因病機和癥狀做出了探討，為后世醫學家提供了理論依據。傳統醫學將GA納入痹證，《素問·痹論篇》明確指出“風、寒、濕三氣”為其外因，認為風寒濕邪滯留經脈乃其病機。《丹溪心法》中指出“彼痛風者，大率因血得熱……寒涼外搏，熱血得寒，污濁凝澀，所以作痛”。《丹溪心法·痛風附肢節痛》指出“遍身骨節疼痛，狀如虎咬，或赤腫灼熱，痛有常處，或渾身壯熱”，這與GA急性發作癥狀非常吻合。

古代醫家將GA視為“富貴病”“帝王將相病”，現在隨著中國經濟水平的提高，人們的飲食和生活條件均發生了結構性的改變，因此GA的患病率逐年上升。94版《中醫病癥診斷療效標準》根據病因病機將GA癥型概括為四型：濕熱蘊結型、瘀熱阻滯型、痰濁阻滯型、肝腎陰虛型，其中濕熱蘊結型的主癥為患處卒然紅腫熱痛、拒按，觸之灼熱，得熱則劇、得涼則舒，兼癥伴口渴，舌紅，苔黃膩，脈滑數。國醫大師朱良春［13］認為GA多有飲酒及喜食膏粱厚味的習慣，其病機為臟腑升清降濁功能失衡，濕濁瘀滯內阻，痰濕阻滯經脈而發病，創立濁瘀痹。鄧運明［14］指出GA病位在中焦脾胃，病機以脾胃失和為本，濕熱痹阻為標，于是提出“固中清消”之法，即固護中焦，清熱化濕。張有為等［15］研究提示臨床GA中醫證型主要是濕熱蘊結證（56.99 %）。謝靜靜等［16］通過對深圳地區GA患者橫斷面調查研究GA中醫證型也是以濕熱蘊結證為主。劉靖晗等［17］通過2名專業醫師對患者一般資料和臨床表現歸納發現GA患者中醫證型以濕熱蘊結證為主且GA部位多發于第1跖趾關節及踝關節。綜上所述GA主要證型為濕熱蘊結證，基本病機為飲食不節和外感風寒濕熱等淫邪致使脾失健運，津液代謝失常，聚而為濕，濕熱痰濁瘀阻經脈。

2 濕熱證急性GA動物模型的研究現狀

2.1 GA模型 目前國內外常用的GA動物模型，主要選用大鼠或兔作為造模動物，制備急性GA或慢性GA動物模型。最直接的方法是模擬臨床患者病理特征直接在模型動物關節腔內注射MSU晶體。Coderre最早采用該法，將MSU晶體混懸液注入雄性SD大鼠關節腔內誘導炎癥的發生，進而制備急性GA模型，通過觀察大鼠關節體征改變和足趾容積測量儀測量前后6 h內關節體積的變化來判斷是否造模成功［18］。Coderre法具有穩定、簡便、易操作等優點，但與人類急性GA發作是由于尿酸鹽濃度達到一定閾值7.0 mg / dL（420 μmol/ L）時促進機體關節內MSU晶體的沉積不同，因此不能從本質上模擬臨床患者急性GA發作，僅適用于單一關節炎癥狀的研究，用于篩選急性GA抗炎藥物。宋娟等［19］改進Coderre法，麻醉后將大鼠一側踝關節固定至90°并常規消毒，然后用6號針沿跟腱內側與脛骨呈30°～ 40°方向進針向踝關節腔內注射50 μLMSU晶體混懸液（20 mg/mL），該法從后側間隙進針可避免損傷關節軟骨導致創傷性骨關節炎的發生進而影響實驗結果。黃火高等［20］改良MSU晶體的制備，并利用改良的Coderre法將50 μL不同梯度濃度MSU晶體混懸液注入Wistar大鼠踝關節腔內，誘導典型急性GA，結果表明濃度在5～20 mg/mL×50μL內炎癥反應呈劑量效應關系。該法不僅證明誘導急性GA的MSU劑量以20 mg·mL-1×50 μL最佳，也證明改良的MSU晶體制備法形態與機體患處沉積的MSU晶體相似提高模型的可復制性。

2.2 濕熱證模型 盡管目前有較多關于濕熱證動物模型的報道，但多局限于濕阻證和溫病濕熱模型方面的研究。中醫學理論認為脾胃濕熱證形成的基礎是飲食內傷導致脾胃功能失調所致。吳仕九等［21］對濕熱證的造模進行了多方面研究，采用綜合因素高糖高脂+人工氣候箱（溫度35 ℃、相對濕度95 %）+鼠傷寒桿菌造模，成功復制濕熱證動物模型，并以發熱、神倦、食量、糞便等指標將濕熱證的臨床表現轉化為動物辯證可行的四診合參。該法根據“脾胃內傷，濕邪內生，外邪再至，內外相引，故病濕熱”理論，其中肥甘厚膩飲食損及脾胃造成內濕后以鼠傷寒桿菌感染為外邪，內外引觸而致病，從發病機理探討屬于溫病濕熱模型，且與中醫濕熱證型的主要癥狀和體征大體相似。湯朝暉等［22］以不同致病因素為外邪觀察其溫病濕熱證模型的特征，結果提示“內濕”形成主要在于滋膩厚味飲食內傷脾胃導致水液代謝失常濕聚成痰并提出血脂作為濕熱證動物模型的微觀評價指標。

3 GA病證結合模型評價體系的建立

3.1 行為學評價 辨證論治是祖國醫學在臨床診斷中最基本的特征，主要依賴于中醫望聞問切對采集的癥狀和體征進行判別。由于動物和人體的先天差異，其無法通過語言來表述身體變化，這限制了中醫望聞問切在動物模型評價體系的運用。但我們可加強挖掘動物行為學的改變從而將臨床中醫評價體系運用于動物模型。通過觀察動物的精神面貌分析是否倦怠乏力；通過稱量體重、飲食和飲水量分析食欲改變；通過糞便和尿液分析大小便情況；通過測量肛周溫度分析是否發熱，也可借助舌象分析儀，心電圖等現代化儀器，實現動物行為學改變到中醫望聞問切的轉化，從而達到四診指標的客觀化、標準化［23］。

3.2 微觀病理評價 研究表明，GA的炎癥反應與復雜的細胞和細胞因子網絡有關，IL-1β、TNF-α等是GA相關炎性因子［24］。IL-1β在GA急性發作與消退中起著非常關鍵的作用，是最經典的致炎因子［25］。沉積關節的MSU晶體作為急性GA炎癥發作的啟動因素，通過活化NLRP3炎癥因子/炎癥小體并激活效應蛋白胱天冬肽酶-1，進而將無任何生物活性的白細胞介素-1前體（pro-IL-1β）剪切加工為活性IL-1β［26］，介導炎癥反應的發生。pro-IL-1β產生的重要途徑是由NF-κB（nuclear factor κB，NF-κB）介導的TLR/核因子κB信號通路［27］。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是維持機體免疫平衡的重要活性物質，具有雙重生物學效應，既是炎癥反應的啟動因子，又是炎癥持續誘發因子［28］。臨床急性GA發作病程中TNF-α發揮重要的調控作用，并且在患者關節液、滑膜及血清中均檢測到TNF-α異常表達［29］。濕熱環境引起機體分泌內生致熱原TNF-α、IL-1細胞因子分泌增加，導致體溫升高，從而產生身蜷倦怠、呃逆、大便粘滯不爽等溫病濕熱證樣［30］。研究還發現濕熱外環境可上調TNF-α的基因表達以介導更多的炎癥因子的產生最終導致炎癥級聯反應，這可能正是濕熱證形成的一個重要環節［31］。IL-1β、TNF-α既是濕熱證的主要致病機理，也可作為濕熱病證的客觀性微觀評價指標。此外對不同中醫證型的急性GA致炎因子進行測定，結果顯示：濕熱蘊結證中IL-1β和TNF-α明顯高于其他證型［32］。

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類由內在膜蛋白組成的高度選擇性跨膜通道。在維持機體水液代謝的正常生理情況下，AQPs始終保持激活狀態，通過參與自由水的分泌、吸收介導水的生物膜轉運，對保持生物體水恒定及細胞微環境的穩態起核心作用，是保持機體水代謝平衡的分子學基礎［33］。濕熱證“濕”的產生與機體水液平衡代謝紊亂有著必然聯系［21］，責之于各臟腑（主要是肺脾腎）水液疏布功能障礙。其中AQP2是腎臟最常見的AQPs之一，是腎臟集合管水重吸收的核心蛋白，也是目前已知唯一對抗利尿激素（ADH）敏感的水通道蛋白［34］。在濕熱證的微觀病理狀態下，AQPs的改變，是“濕熱”之“濕”存在于機體的重要病理機制之一［35］。

體溫上升是濕熱證的體征之一。血漿內皮素（endothelins，ET）是目前已知作用效果最強的縮血管活性物質而降鈣素基因相關肽(calcium generelated peptide，CGRP)具有持久、強烈的舒血管作用，可能ET存在生理拮抗，二者相互作用可調節全身血管的收縮與擴張從而改變循環系統中血流量變化并影響機體散熱系統進而控制機體體溫變化［36-37］。研究發現濕熱證模型血漿ET含量高于空白對照組而CGRP含量則下降，這證實了濕熱證的體溫升高，其“熱”的生理機制、量化評定與ET-CGRP反饋調控密切相關。

4 小結與展望

西醫學特征是辨病，中醫學特征是辨證論治，過去單純的“病”或“證”動物模型在中醫臨床與基礎研究的對接過程中無法很好銜接，因此諸多研究轉為將西醫疾病觀和中醫基礎理論相結合構建二者均具備的病證結合動物模型，目的使中醫臨床與基礎研究相銜接。從中醫基本理論出發將“證”和臨床“病”特征相結合模擬濕熱證急性GA發病環境、因素構建病癥結合動物模型，同時探索病證結合動物模型評價體系，提出把動物行為學的改變結合微觀生化指標檢測轉化為中醫臨床的望聞問切，從而將四診合參運用于動物模型評價，將IL-1和TNF-α炎性因子用于炎癥反應程度評價，AQPs、CGRP和ET作為濕熱證的評價指標。