TSP-1在角膜新生血管生成的作用機制

趙田田，崔 俊，崔仁哲

(延邊大學附屬醫院眼一科，吉林 延吉 133000)

無血管狀態是眼角膜透明度及免疫耐受功能的基礎，而感染、外傷、免疫反應等病理條件可導致新生血管形成。在富含血管的環境中，由于存在內源性血管生成抑制因子，角膜仍然保持著無血管化狀態。血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)是一種強有力的內源性抗血管生成因子和重要的細胞外基質蛋白，可調節和影響內皮細胞的黏附、增殖和運動，與多種新生血管性疾病的發生發展有關。目前，研究發現TSP-1在維持眼內血管平衡中起著重要作用。現對TSP-1在角膜新生血管中的作用及機制進行綜述。

正常情況下角膜透明，沒有血管，周圍的血管從角膜緣斷開。在退化、缺氧、創傷、感染和炎性反應等條件下，角膜緣的血管內皮細胞向角膜基質內生長，形成角膜新生血管(Corneal neovascularization，CNV)。這是一種威脅視力的疾病，每年影響超過140萬人，如果不進行治療，便會導致組織瘢痕形成、水腫、持續性炎癥、星形膠質細胞內的蛋白質和脂質沉積，將顯著影響視力預后和生活質量[1]。伴隨著分子生物學、免疫學、免疫組織化學等學科和技術的發展，CNV的研究取得了突破性進展，目前研究發現TSP-1在維持眼內血管平衡中起著重要作用。探討TSP-1與角膜新生血管形成和發展的關系，對預防和治療角膜新生血管疾病具有重要意義。

1 TSP-1 的結構與生物學活性

Good等人于1990年第一次從人類血小板中成功分離出了一種重要的細胞外基質蛋白TSP-1，并證實了TSP-1抑制血管形成[2]。TSP-1是一個編碼15q15基因的450KD糖蛋白，位于由3條重復肽鏈的同源三聚體組成，其線性排列中包含6個主要結構域，每一個結構域均負責特定功能：①氨基末端是肝素結合區域，負責 TSP-1蛋白的遷移、攝取和細胞的黏附、趨化；②半胱氨酸區域與前膠原同源，通過亞單位聚集抑制血管新生；③3個I型重復序列的區域，能調控軸突生長、細胞間接觸、抑制血管新生和內皮細胞增殖、誘導內皮細胞凋亡；④3個與表皮生長因子同源的Ⅱ型重復序列，與可溶性基質蛋白相互作用；⑤7個與鈣結合位點同源的Ⅲ型重復序列；⑥球形羧基末端參與細胞黏附、遷移、一氧化氮信號與血小板聚集[3]。其中TSP-1的抗血管生成活性是在前膠原同源區和I型重復序列中發現，TSP-1能與多種含硫酸乙酰肝素糖蛋白、膠原蛋白和纖維連接蛋白的基質成分相互作用，它們對基質的穩定性和重建起著重要作用。TSP-1在巨噬細胞中介導對凋亡白細胞的識別和吞噬，參與了炎性反應的后期過程，限制了其促炎作用。TSP-1的一個基本和公認的特性是通過抑制血管內皮生長因子的活性和氣體遞質一氧化氮的多效信號來限制內皮細胞介導的血管生成。TSP-1的主要細胞表面受體CD36、CD47和整合素參與重要的細胞過程，包括凋亡、血管生成、血流、吞噬、遷移和免疫調節[4]。

2 角膜新生血管生成的過程與機制

2.1血管生成的過程:血管生成一個嚴格調控的過程，原始血管內皮細胞分裂及增殖，產生新的毛細血管。該過程包括：①內皮細胞的活化和形成血管生成表型；②原始血管基底膜的降解及周圍基質的選擇性重塑；③內皮細胞的增殖、遷移、形成管狀結構；④新生血管的形成和新血管的循環[5]。此過程依賴于一系列血管生成抑制因子和刺激因子之間的相對平衡。一般來說，人體內的血管處于靜息狀態，組織微環境中的抑制因素占主導地位，因此不會出現新生血管。隨著組織損傷、腫瘤、炎性的發生，局部微環境的改變會刺激內皮細胞、腫瘤細胞和巨噬細胞，產生大量的新生血管形成因子，從而打破原有組織調控血管生成的平衡，即血管生成[6]。

2.2CNV的形成機制:①細胞因子平衡學說：正常情況下，低濃度的血管生成促進因子和高濃度的抗血管生成因子處于復雜而精細的平衡狀態，使角膜透明、無血管化，在病理狀態下一旦這種平衡被打破，就會產生角膜新生血管。CNV的形成是比較復雜的病理生理過程，主要表現為：新生血管部位原有毛細血管的改變、內皮細胞向刺激物的移動、內皮細胞在運動后數量明顯增加、新的毛細血管形成、基底膜的形成。但是，目前還不清楚CNV發生的詳細機制，可能與以下因素有關：缺氧、減少抗血管生成因子、增加促血管生成因子、角膜神經損傷、角膜水腫、免疫炎性反應、角膜緣解剖及功能微環境改變的異常等。②角膜緣屏障假說：角膜上皮細胞通過角膜緣不斷更新，角膜基質中的膠原蛋白排列整齊、緊密，作為屏障阻止血管的侵入，發揮物理屏障的作用，阻止導管與結膜的過度生長[7]。在角膜水腫的狀態下，致密堆積的板層膠原蛋白被分離，屏障功能受損，角膜緣新生血管無法阻止，于是形成CNV[8]。然而，這一理論不能解釋某些特殊病例如角膜營養不良和內皮失代償可引起角膜基質水腫但不能引起CNV。所以，破壞角膜緣屏障功能并不是CNV發生的唯一機制，可能是與其他機制相互作用的結果。

3 TSP-1抑制血管生成的可能機制

促血管生成信號轉導途徑和抗血管生成信號轉導途徑之間的交叉作用可能使TSP-1通過拮抗生存途徑和激活凋亡途徑抑制血管生成，TSP-1通過直接影響內皮細胞的存活和遷移以及間接影響生長因子的動員抑制血管新生。以下是TSP-1抑制血管新生的5種可能作用機制：①抑制內皮細胞的增殖和遷移：TSP-1能抑制內皮細胞與基質纖維功能蛋白的粘附，從而減少內皮細胞的局部黏附點，間接抑制內皮細胞增殖，其作用由TSP-1氨基末端的肝素結合區介導[9]。TSP-l通過競爭生長因子內皮細胞的結合位點來抑制由生長因子刺激的細胞增殖，TSP-1還可通過Akt/MAPK途徑抑制內皮細胞周期進程和增殖，并以CD36的獨立的方式抑制新生血管形成[10]。抗CD36的IgM抗體SM、膠原蛋白和氧化低密度脂蛋白可以模擬TSP-1與CD36結合，抑制了人微血管內皮細胞的遷移；此外，在應激過程中TSP-1的表達促進了細胞活力，阻止了細胞遷移，并通過減少NO的產生而減少了小管形成[11]。②誘導內皮細胞凋亡：Nyor等發現TSP-l介導的血管生成的抑制和內皮細胞的凋亡與促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低以及加工激活caspase-3有關[12]。TSP-1還可通過激活CD36-Fyn-caspase-3-p38MAPK級聯反應，誘導血管內皮細胞凋亡和負向調控血管生成[13]。③抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)信號：TSP-1已顯示通過與內皮細胞表面受體CD36和CD47結合來拮抗促血管生成NO信號通路，在NO存在的情況下TSP-1是一種100倍的血管生成抑制劑[14]。④基質屏障功能：Chan等研究表明，TSP-1在角膜緣形成天然屏障，阻止血管侵入角膜基質，在高表達TSP-1的小鼠中角膜緣產生的新生血管減少[15]。⑤拮抗血管內皮生長因子的生物利用度和活性：通過抑制MMP-9的活化，TSP-1可抑制細胞外基質中血管內皮生長因子(VEGF)的釋放。TSP-1能通過直接與VEGF結合介導細胞外液對VEGF的攝取和清除，抑制CNV[13]。另外，TSP-1可阻斷VEGF信號傳導，抑制了VEGFR2的磷酸化，并降低Akt途徑的激活[13]。最新研究證實，在角膜新生血管的形成中TSP-1發揮著重要的作用。目前，尚需進一步研究TSP-1在CNV中的調節作用，為尋找治療角膜新生血管的新策略提供指導。Haviv等根據人TSP-1的第二個I型重復序列合成了一系列肽，研究發現ABT-510和ABT-526是第一類模擬TSP-1抗血管生成功能的有效血管生成抑制劑[16]。ABT-510能有效地阻斷小鼠基質凝膠塞模型中的新生血管，ABT-526對大鼠角膜新生血管有抑制作用。在兔角膜中TSP-1能抑制成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)引起的血管生成。已經發現TSP-1能夠促進兔角膜基質中的血管生成，并且能夠抑制FGF-2在相同組織中的血管生成。其雙重作用可由不同的結構域引起，其活化血管內皮細胞降解和侵襲的能力也不同[17]。

4 小結

TSP-1能抑制CNV的形成，為今后角膜新生血管的治療與探索提出新的思路與方向，因為TSP-1分子量大、結構復雜、數量少、生物活性多樣等特點，使完整的TSP-1無法直接用于臨床治療。鑒于CNV是由多種病理因素形成的，我們將闡明TSP-1在信號轉導中的作用及多種細胞分子之間的相互作用，以探索出更有效的治療方法。但是，如果將其衍生的小肽用于CNV的治療，發揮誘導內皮細胞凋亡和抗血管生成的作用，將會給CNV治療的研究帶來新的局面。玻璃體腔內注射TSP-1模擬肽后，角膜新生血管衰減，小鼠經注射TSP-1肽后CNV面積明顯減小。另外，調節TSP-1或其抗血管生成模擬肽的表達可能為CNV的治療提供新的途徑。