成骨過程中細胞內能量代謝研究進展

葉嘉鵬 王建偉 馬勇 張亞峰 張強 張宗瑞 尹恒,* 肖吉日木圖,3 李紹爍

1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210038 2. 南京中醫藥大學無錫附屬醫院，江蘇 無錫 214071 3. 內蒙古醫科大學，內蒙古自治區 呼和浩特 010110

骨質疏松癥是一個危害老年人生活質量的公共健康問題，骨的形成依賴于骨組織中產生足夠數量的成骨細胞以及單個成骨細胞的活性[1]。成骨細胞能量代謝會影響其分化和功能。這些細胞用來產生ATP的物質來源和途徑正在被廣泛研究，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸在細胞內的代謝變化。細胞的變化如分化和增殖，可以引起新陳代謝的變化，也可以依賴于新陳代謝，不同的細胞根據細胞自身的功能和環境表現出不同的能量供應需求。在骨髓間充質干細胞(BMSC)分化為成骨祖細胞，再到極化、高度成熟的成骨細胞過程中，細胞內代謝會不斷的改變，與細胞功能相適應。

1 成骨細胞內的葡萄糖代謝

1.1 葡萄糖代謝途徑

葡萄糖代謝中糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑是較為常見的代謝途徑[2]，葡萄糖通過其轉運蛋白(GLUT)轉運到細胞內，通過糖酵解產生兩分子丙酮酸、兩分子ATP以及兩分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。丙酮酸可以被乳酸脫氫酶(LDH)轉化為乳酸，這個反應可以再生糖酵解所需的NAD+。丙酮酸還可以進入線粒體通過丙酮酸脫氫酶復合物(PDH)脫羧形成乙酰CoA后進入三羧酸(TCA)循環。TCA循環不僅通過氧化磷酸(OxPhos)化產生ATP，而且還提供中間分子參與細胞的生物合成。糖酵解中間產物還可以進入細胞內的其他代謝途徑，葡萄糖-6-磷酸(G6P)可以轉化為糖原儲存或通過磷酸戊糖途徑(PPP)代謝。PPP不僅產生合成核酸的5-磷酸核糖，而且還可以產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。來源于G6P的果糖6磷酸(F6P)可以進入己糖胺生物合成途徑(HBP)，產生尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)用于蛋白質糖基化。

1.2 成骨過程中細胞內葡萄糖攝取

成骨細胞已經被證明[3]表達幾個GLUT家族轉運蛋白，例如 GLUT1、GLUT3和GLUT4 ，它們參與葡萄糖代謝和調控成骨細胞功能。GLUT1在成骨細胞譜系中表達水平最高，與Runx 2參與一種前饋機制，葡萄糖通過抑制AMPK依賴性的Runx 2蛋白酶體降解來促進成骨分化，并通過抑制AMPK來促進骨形成，其次還能通過誘導mTORC1介導的蛋白合成促進膠原基質的生成[4]。Mst1/2激酶在骨骼發育和重塑過程中是葡萄糖攝取所必需的，Mst1/2激酶穩定了成骨細胞中主要的葡萄糖轉運蛋白GLUT1，從而調節AMPK的活性，抑制GLUT1的表達會激活AMPK，并通過泛素化導致Runx 2的降解，從而減弱骨形成[5]。葡萄糖進入骨組織還少部分受到胰島素的調節，喂食高脂飲食和具有成骨細胞特異性胰島素受體缺失的小鼠模型顯示，骨組織對葡萄糖攝取下降[6]。GLUT4 (由Slc2a4編碼)是原代成骨細胞分化過程中唯一表達增加的葡萄糖轉運體，它需要胰島素的刺激來吸收葡萄糖，slc2a4缺失的原代成骨細胞顯示出由骨鈣素表達下降和胞外鈣流入減少，然而Slc2a4缺失的小鼠并沒有明顯的骨丟失，卻出現高胰島素血癥和胰島素抵抗[7]。

1.3 成骨過程中細胞內葡萄糖的分解代謝

分化的成骨細胞的糖酵解和OxPhos水平都高于未分化的細胞，但OCR(耗氧率)/ECAR(細胞外酸化率)比率逐漸下降，分化后的細胞傾向糖酵解，即使在氧氣存在的情況下，也以糖酵解為主，這種現象類似于癌細胞中的Warburg效應[8]。Guntur等[9]的研究同樣發現分化的MC3T3-E1成骨細胞主要通過糖酵解來滿足ATP的需求，而未分化的細胞則通過OxPhos化來產生ATP，但當它們分化為脂肪細胞時，細胞內依然以OxPhos為主，這項研究說明了不同的代謝譜和細胞分化的方向相關。人脂肪來源間充質基質細胞(adMSC)在非分化和成骨誘導條件下，糖酵解標志酶磷酸果糖激酶(PFK)和戊糖磷酸途徑標志酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的含量增加，但在誘導脂肪細胞形成時，伴隨細胞增殖的減弱，糖酵解能力降低，并誘導線粒體酶活性增加，OxPhos加強，說明adMSC在成骨和成脂分化過程中能量代謝與特定細胞分化方向相適應[11]。但為什么細胞依賴于糖酵解這種低效生成ATP的模式，Yang等[12]認為氧糖酵解的必要性是需要以更快的速度產生ATP，提供代謝中間體來支持基質蛋白的合成，增加進入TCA循環的丙酮酸用于產生檸檬酸，這在結構上對骨骼中磷灰石納米晶的形成具有重要意義。而Karner等[13]認為這種代謝方式有助于成骨細胞分化的表觀遺傳調控。然而在人類間充質干細胞(hMSC)在成骨分化過程中，線粒體OxPhos的增加，其糖酵解水平和未分化的細胞相比無明顯改變[10]。Chen等[14]同樣發現未分化的hMSCs表現出較高水平的糖酵解酶和乳酸產率，在hMSCs成骨分化過程中，能量生產從糖酵解過渡到OxPhos。因此不同來源的細胞在成骨分化中有著不同的代謝方式。然而Pattappa等[15]和Esen等[16]使用了含有丙酮酸的培養基，丙酮酸可以直接進入線粒體TCA循環,人為地增加未分化細胞的耗氧量，因此在成骨過程中沒有發現OxPhos的變化。

2 成骨細胞內的脂肪酸代謝

2.1 脂肪酸的代謝途徑

長鏈脂肪酸的運輸是由位于線粒體外膜和內膜的雙肉堿脂酰轉移酶(CPT)介導的。脂肪酸通過脂酰CoA合成酶活化成脂酰CoA，穿過外膜，在肉堿的協助下，通過位于線粒體外膜的CPT1、內膜的肉堿脂酰肉堿轉位酶和CPT2進入線粒體基質。脂肪酸通過活化成脂酰CoA在線粒體內進行β氧化(脫氫、加水、再脫氫、硫解)產生ATP。一個飽和脂肪酸氧化分解成乙酰CoA、NADH和FADH2，乙酰CoA進入TCA循環，而NADH和FADH在電子傳遞鏈中生成ATP。單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸必須異構化和還原，然后才能被β氧化。

2.2 脂肪酸的攝取

富含成骨細胞/骨細胞的股骨干對乳糜微粒的攝取大于骨髓，表明正常的成骨細胞增殖需要血清脂蛋白[17]。成骨細胞表達低密度脂蛋白受體(LDLR)和低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)，LDLR的的消融導致與成骨細胞分化相關的基因表達減少[18]。成骨細胞還表達高密度脂蛋白(HDL)的主要受體Scarb1[19]，BMSC中缺失Scarb1增加了成骨細胞形成，但降低了終末骨細胞分化[20]。但Tourkova等[21]報道缺乏Scarb1的小鼠在16周時骨吸收和骨形成的標志物減少。此外骨吸收的脂肪酸很可能被代謝成ATP，因為體內骨新合成脂肪的量很低[22-23]。成骨細胞還表達CD36直接攝取游離脂肪酸，CD36缺失小鼠骨形成率降低和成骨細胞分化障礙，但CD36在成骨細胞對脂質攝取的具體作用仍有待進一步證明[24]。SLC27脂肪酸轉運蛋白家族，也被成骨細胞用來獲得脂肪酸以供氧化[25]。

2.3 成骨過程中細胞內脂肪酸的分解代謝

脂肪酸可以通過以下方式獲得：葡萄糖底物的從頭合成；膳食來源的乳糜微粒；脂肪細胞；細胞內脂滴的脂解。成骨細胞表達高水平的GlUT1和CPT1a，表現出較高的耗氧水平以及代謝棕櫚酸酯的能力增強，表明其依賴脂肪酸氧化作用，下調CPT1a的表達會阻礙成骨細胞分化，而在骨折修復過程中局部注射游離脂肪酸會增加愈傷組織中形成的骨數量，減少軟骨數量，因為低水平的脂肪酸激活FOXO3促進軟骨形成[26]。研究發現成骨細胞中存在脂滴，未分化的BMSC含有很少的脂滴，而成骨誘導下第2天脂滴增加，7 d后更加明顯，并且檢測成骨基因的表達，用 CPT1抑制劑etomoxir (ETO)阻斷線粒體脂肪酸攝取，發現BMSC成骨分化第0天和第2天的OCR顯著降低，而在第7天成熟的BMSC的OCR略有下降，而ECAR沒有明顯改變，表明在BMSC成骨分化的早期脂滴的快速分解和利用產生ATP，成熟的成骨細胞似乎沒有以類似的程度利用脂肪酸，導致它們隨后的積累[27-28]。雖然在成骨細胞中脂滴分解的機制尚不清楚，但在其他組織中已被描述為通過兩種不同的機制發生：①脂滴相關的細胞質脂肪酶;②自噬小體隔離脂類并隨后被溶酶體酸性脂肪酶降解，稱為脂噬[29]，這兩個過程都導致游離脂肪酸的釋放。PAT家族中脂滴相關蛋白(PLIN1-5)的基因在BMSC中表達，值得注意的是PLIN2在第2天表達量最高，在第7天卻檢測到PLIN2的裂解物[28]。脂滴表面的PLIN2通過伴侶蛋白介導的自噬(CMA)被降解，從而啟動脂解[30]，此外PLIN2已被證明是蛋白酶體降解的靶標[31]，這可能是檢測到PLIN2裂解物的另一個原因。Kim等[22]發現這些儲存的脂質似乎不是成熟成骨細胞功能的主要能量來源，在體外培養的顱骨成骨細胞、成熟成骨細胞和體內成骨細胞中，ATGL的表達均被阻斷，它能消除細胞內脂解作用，但在體外成骨細胞性能和體內骨結構中均未發現缺陷。因此，成骨細胞似乎需要胞外的脂質。然而未分化的BMSC中糖酵解對ATP產量的貢獻率大于97 %，而葡萄糖和脂肪酸的氧化僅貢獻了ATP產量的3 %[32]，而且棕櫚酸酯還誘導BMSC凋亡和抑制增殖，但這種作用被不飽和脂肪酸油酸阻止。此外脂肪酸氧化也能減輕棕櫚酸酯對成骨細胞的負面影響[33]。

3 成骨細胞內的氨基酸代謝

3.1 氨基酸的代謝途徑

氨基酸分為必需和非必需氨基酸,或者分為生酮和生糖氨基酸，是成骨細胞合成蛋白質或代謝產生ATP的基礎原料。其中生酮氨基酸代謝為乙酰CoA或乙酰乙酸鹽，而生糖氨基酸則轉化為丙酮酸或TCA循環的中間體，包括草酰乙酸、戊二酸、富馬酸和琥珀酰CoA。因此，氨基酸可以通過TCA循環和OxPhos直接促進ATP的產生。事實上，TCA循環中的氨基酸分解代謝在多能祖細胞維持和分化是必需的[34-35]。

3.2 氨基酸的攝取

對成骨細胞氨基酸攝取的初步研究定義了骨骼中的多種轉運系統，包括系統A、L和ASC，并提出了成人和胎兒骨骼之間氨基酸轉運的差異，還發現cAMP、甲狀腺素、胰島素和IGF1在成骨細胞中調節氨基酸的轉運[36]。研究[37]表明，單個氨基酸轉運體與骨生物學有關，例如胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體XCT可能通過減少谷胱甘肽的產生來抑制成骨細胞的分化。ATF4轉錄調控一系列編碼氨基酸轉運體和氨基酸合成酶的基因，以增加氨基酸獲取，GCN2通過增加ATF4下游的氨基酸攝取來調節小鼠骨祖細胞(SSPC)的增殖，有利于維持骨穩態[38]。

3.3 成骨過程中氨基酸的分解代謝

谷氨酰胺是血液中最豐富的氨基酸，谷氨酰胺通過谷氨酰胺酶(GLS)轉化為谷氨酸，然后轉化為α-酮戊二酸(α-KG)，進入TCA循環，而且大部分TCA循環的碳和一些非必需氨基酸中的氮來自細胞中降解的谷氨酰胺[39-40]。骨髓基質細胞消耗的谷氨酰胺減少與衰老相關的成骨細胞分化受損有關[41]，成骨細胞內的GLS和谷氨酰胺代謝可以促進骨骼干細胞(SSCs)的增殖和向成骨細胞的分化，促進基質礦化以增加骨量[42]。有研究[43]表明，miRNA-206通過結合GLSmRNA，抑制GLS的表達和谷氨酰胺代謝，最終抑制BMSC的成骨分化。BMSC在成骨分化時代謝大量的谷氨酰胺，進入TCA循環中提供ATP，而對檸檬酸的貢獻下降，谷氨酰胺還可以通過增加谷胱甘肽含量抵消ROS對成骨分化的不利影響。另外，與對抗ROS的積極作用相比，谷氨酰胺對BMSC成脂分化的影響較小，線粒體產生的ROS以mTORC1依賴的方式促進脂肪細胞的分化，這可以解釋脂肪細胞分化過程中谷氨酰胺消耗和GLS活性相對于未分化的BMSCs沒有改變的現象[44-45]。而骨祖細胞的增殖似乎與谷氨酰胺相關性不大，這表明不同類型的細胞中谷氨酰胺代謝的不同作用[46]。同樣在ST2細胞內谷氨酰胺分解代謝的增加促進了細胞蛋白質的生物合成[47]。與預分化細胞相比，分化的脂肪細胞(3T3L1)特異性地利用了支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸[48]，這些氨基酸在成骨細胞分化中所起的作用目前尚不清楚。谷氨酰胺對骨骼中能量的產生和氧化還原平衡都起著關鍵作用，這可能是治療骨質疏松癥的新策略。已有研究[41,49]報道衰老相關的谷氨酰胺代謝的改變可通過破壞谷氨酰胺代謝關鍵酶或線粒體代謝惡化來打破BMSC成骨分化和成脂分化之間的平衡。谷氨酰胺的前體2-氧化戊二酸(2-Ox)在胃底切除導致的骨量減少的骨骼中增加松質骨、生長板和關節軟骨的厚度[50]。它還應用于糖皮質激素引起的骨質疏松癥，提高了生長激素和骨鈣素的濃度，并維持骨小梁的微結構[51]。此外蛋白質和氨基酸攝入可以促進成骨細胞分化和增加骨密度，但過多攝入酸化氨基酸 ( 如半胱氨酸和甲硫氨酸) 會增加患骨質疏松癥的風險[52-53]。

4 討論

盡管轉錄因子和信號通路已經被廣泛研究，但對成骨過程中細胞代謝的狀態了解較少，由于體外實驗無法完全模擬體內骨髓環境，未來的研究需要進一步明確成骨細胞在骨髓環境中不同分化階段的代謝表型。而代謝變化對成骨細胞分化和功能影響的分子基礎有待研究闡明。骨形成過程中葡萄糖、脂質、氨基酸在細胞成骨過程中的動態能量分配需要進一步研究。此外，了解破骨細胞、骨細胞和脂肪細胞等其他骨組織內細胞的生物能量學對于全面了解骨的代謝調節是很必要的。這些研究成果將來可以應用于慢性代謝性骨病的治療，還能應用于針對新靶點藥物的研發。