低強度脈沖超聲通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞增殖的研究

林喬 周鋼 黎靖毅 楊松 黃志鵬 毛漢儒 林堅平

海南省人民醫院關節外科，海南 海口 570000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見于老年人的以骨密度減低和骨微結構損壞為特征的疾病[1]。據統計，我國50歲以上人群中，女性OP的患病率為20.7%，男性為14.4%[2]。OP常導致骨質疏松性骨折，據估計，全世界每年因骨質疏松癥發生的脆性骨折超890萬例[3]。根據預測，我國2035年用于治療脆性骨折的醫療費用將高達1 320億元人民幣[2]。可見，OP為家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔，因此，有必要深入研究促成骨的方法和機制，有效預防和治療OP。

低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一種具有非熱效應的超聲，它以脈沖波的模式輸出，其強度較傳統超聲能量低(<3 W/cm2)[4]。LIPUS因其促成骨效應已被美國FDA批準用于促進新鮮骨折的愈合和治療骨折的延遲愈合或不愈合[5]。機械敏感離子通道蛋白PIEZO1是一種非選擇性的陽離子通道蛋白[6]，可將細胞外的機械信號轉導為細胞內的化學信號，調控細胞的增殖和凋亡[7]。磷脂酰肌醇3激酶信號通路(PI3K/AKT/mTOR)被證實與成骨細胞的增殖活動有關[8]。最新的研究表明機械敏感離子通道蛋白PIEZO1對其抑制劑Yoda-1的敏感性可經PI3K/AKT/mTOR信號通路調控[9]，因此，PIEZO1和PI3K/AKT/mTOR信號通路存在著一定的關聯。綜上，筆者提出如下科學假設，即LIPUS可通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞的增殖。為了驗證這一假設，本研究設計并進行了該實驗，以期完善LIPUS的促成骨機制，尋找治療OP的潛在分子靶點和方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

MC3T3-E1成骨細胞(中國醫學科學院)、α-MEM培養基、PBS(中杉金橋，中國)、胎牛血清、胰蛋白酶(Sigma，美國)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(博士德，中國)、PVDF膜(Millpore，德國)、ECL化學發光液(Pierce，美國)、β-actin一抗(中杉金橋，中國)、PIEZO1一抗(Novus，美國)、山羊抗兔二抗(中杉金橋，中國)、GsMTx4(Tocris，英國)、PI3K抗體(Abcam，英國)、Phospho-PI3K抗體(CST，美國)、AKT抗體(Abcam，英國)、Phospho-AKT抗體(CST，美國)、mTOR抗體(Abcam，英國)、Phospho-mTOR抗體(CST，美國)、重組Anti-Cyclin D1抗體(Abcam，英國)、CCK-8試劑盒(日本同仁)、低強度脈沖超聲儀(Metron GS170，澳大利亞)、電泳儀(伯樂，美國)、電轉儀(伯樂，美國)、臺式離心機(東旺儀器，中國)。

1.2 細胞培養

將小鼠MC3T3-E1成骨細胞接種于培養瓶中，加入4 mL完全培養基后置于培養箱中培養，每隔2 d換液一次(嚴格執行無菌操作)，并在顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長滿瓶底80%的區域時進行傳代培養。

1.3 加載低強度脈沖超聲

時間梯度實驗分為對照組和LIPUS組，將兩組細胞培養皿分別置于GS170超聲儀換能器下加載LIPUS，加載時間為1、6、12、18、24、36 h。機制實驗分為對照組、LIPUS組、LIPUS+GsMTx4組(PIEZO1的特異性抑制劑)和GsMTx4組，其中LIPUS+GsMTx4組的細胞在使用PIEZO1的特異性抑制劑GsMTx4處理后再加載LIPUS，而LIPUS組直接加載LIPUS。Metron GS170低強度脈沖超聲儀的參數為：脈沖頻率(100±3)Hz，脈沖寬度(2±3)ms，間隔時間(8±3)ms，脈沖占空比為1∶4(20)±3。

1.4 CCK-8實驗

將各組細胞取100 μL加入96孔細胞培養板中，取CCK-8溶液10 μL加入96孔細胞培養板中，在37 ℃培養箱中孵育4 h后測各組450 nm吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡實驗

對各組細胞施加完干預措施后提取各組的總蛋白，測定上樣量后加入緩沖液煮沸，-80 ℃凍存備用。標準制膠后依次向孔中加入Marker和各組樣本，設定好電泳參數后開始電泳，電泳結束后，將PVDF條帶敷于Marker指示的相應分子量處開始電轉，電轉結束后將條帶置于相應一抗試劑管中孵育1 h，4 ℃冰箱過夜，第二天在搖床上繼續孵育1 h后洗膜30 min，孵育二抗1 h，洗膜30 min后曝光。

1.6 統計學分析

所有實驗數據均重復3次，WB條帶灰度值使用Image J測定，使用Graphpad Prism 8.0軟件制圖，統計方法使用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 LIPUS可促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖

使用CCK-8檢測MC3T3-E1成骨細胞在加載1、6、12、18、24、36 h的LIPUS后的增殖活力(見表1)，研究發現加載1 h和6 h LIPUS后MC3T3-E1成骨細胞的增殖活力與對照組無明顯差異(P>0.05)，直到加載12 h LIPUS后，LIPUS組和對照組MC3T3-E1成骨細胞增殖活力出現顯著差異(P<0.05)，加載LIPUS 18、24、36 h后兩組細胞的增殖活力均有顯著差異，但增殖活力均較12 h有所下降。綜上表明，LIPUS可顯著促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖活力，加載12 h時增殖活力最強。

表1 CCK-8檢測LIPUS組和對照組成骨細胞增殖活力(重復3次所得各組450 nm吸光度)

2.2 LIPUS通過PIEZO1促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖

研究發現LIPUS組PIEZO1的表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，LIPUS組Cyclin D1的表達水平也顯著高于對照組(P<0.001)(詳細灰度值數據見表2)。這表明，LIPUS可能是通過上調PIEZO1的表達進而促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖。

表2 PIEZO1和Cyclin D1在LIPUS組和對照組的表達情況(重復3次條帶灰度值)

2.3 LIPUS通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞增殖

各組蛋白表達情況見圖1A，研究發現，LIPUS組p-PI3K的表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1B)。如圖1C所示，各組間PI3K的表達水平無明顯差異(P>0.05)。此外，LIPUS組p-AKT的表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1D)，而AKT的表達水平在各組間的差異無統計學意義(P>0.05)(圖1E)。p-mTOR的情況和p-AKT一樣，LIPUS組表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1F)，而各組間mTOR的表達水平無顯著差異(P>0.05)(圖1G)。研究還發現，LIPUS組Cyclin D1的表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1H)。綜上表明，LIPUS可通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號通路促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖。

圖1 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和Cyclin D1在對照組、LIPUS組、LIPUS+GsMTx4組和GsMTx4組的表達水平(ns P>0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.1 The expression levels of p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR, and Cyclin D1 in the Control group, LIPUS group, LIPUS+GsMTx4 group, and GsMTx4 group (ns P>0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

3 討論

雖然LIPUS促進成骨細胞增殖的研究頗多[10-11]，但機制層面涉及PIEZO1的研究尚無，本研究首次證實LIPUS可通過調控PIEZO1的表達進而調控PI3K-AKT-mTOR信號通路，從而促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖。本研究發現12 h的LIPUS可上調機械敏感離子通道蛋白PIEZO1的表達，進而通過促進PI3K的磷酸化，即上調p-PI3K的表達，進而促進AKT的磷酸化，在p-AKT水平升高后又促進p-mTOR的表達，從而促進Cyclin D1的表達，促使細胞周期從G1期進入S期[12-13]，促進成骨細胞增殖。

機械敏感離子通道PIEZO1是骨骼發育和成骨細胞分化的關鍵物理傳感器，骨髓間充質干細胞和成骨干細胞中PIEZO1的缺失會抑制骨骼發育，引起小鼠自發性骨折[14]。也有研究證實成骨細胞中PIEZO1的缺失會導致骨量減少和自發性骨折[15]。相反，對成年小鼠使用PIEZO1的激動劑會增加小鼠骨骼質量[16]。本研究也證實，上調PIEZO1的表達會促進成骨細胞增殖，相反，使用PIEZO1的特異性抑制劑GsMTx4會抑制MC3T3-E1成骨細胞的增殖。這些結果表明，PIEZO1對成骨細胞的分化和增殖甚至是機體骨骼發育至關重要。

近20多年來，骨折患者一直使用LIPUS作為輔助療法來促進骨折愈合，美國FDA也已經基于使用LIPUS患者的影像學結果將LIPUS批準用于治療骨折或骨折不愈合[17]。LIPUS之所以能促進骨折愈合，是因為它能作用于成骨細胞，促進成骨細胞的增殖與礦化結節的形成，有研究發現，將成骨細胞MC3T3-E1暴露于1 MHz、0.2 W/cm2和20%的占空比的LIPUS 30 min，并分析細胞上清液中膠原蛋白、磷酸鹽、堿性磷酸酶和轉化生長因子β1(TGF-β1)的濃度，結果表明，LIPUS暴露后192 h，細胞上清液中的膠原蛋白、磷酸鹽和鈣水平降低。但堿性磷酸酶和TGF-β1的濃度保持不變，這說明LIPUS能夠通過鈣和磷酸鹽的吸收刺激MC3T3-E1前體成骨細胞的分化和礦化，從而形成礦化結節[18]。這在一定程度上闡述了LIPUS的促成骨機制，本研究也將LIPUS作用于MC3T3-E1成骨細胞，并發現LIPUS可通過PIEZO1激活PI3K-AKT-mTOR信號通路促進成骨細胞的增殖。在一定程度上佐證了前人的研究，也進一步完善了LIPUS的促成骨機制。

在正常細胞中，mTOR的活性受上游正負調節劑的調控。正性調節劑包括生長因子及其受體，例如胰島素樣生長因子-1及其受體、人表皮生長因子受體家族成員和相關配體、血管內皮細胞生長因子受體及其配體，可通過PI3K-AKT將信號傳遞至mTOR，從而發揮生物學功能[19-20]。本研究中，PIEZO1在感受到LIPUS的刺激后，會引起PI3K的磷酸化，p-PI3K會進一步將信號傳遞至AKT和mTOR，活化的mTOR會進一步參與細胞的增殖活動。本研究發現LIPUS和PIEZO1也是mTOR活性的正性調節劑，也進一步完善了mTOR活性變化的調控機制。

本研究系首次證實LIPUS可通過機械敏感離子通道蛋白PIEZO1進一步活化PI3K-AKT-mTOR信號通路進而促進成骨細胞的增殖，完善了LIPUS的促成骨機制，也為LIPUS治療局部骨質疏松奠定了一定的理論基礎。當然本研究也有諸多局限性，首先，沒有使用小干擾RNA沉默PIEZO1的表達，抑制劑抑制可能不徹底，可能對結果造成誤差；其次，僅在蛋白水平探討了LIPUS通過PIEZO1對成骨細胞增殖的影響，而沒有從基因水平深入研究，可能影響實驗結果。

綜上所述，低強度脈沖超聲可通過調控PIEZO1的表達經PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞增殖。