齊墩果酸局部給藥對去卵巢小鼠骨折愈合的影響

程韶 楊駿杰 王晶 趙永見1,2, 唐德志1,2, 張巖1,2, 趙東峰1,2, 孫悅禮1,2, 趙世天1,2, 陶渝仁1,2, 施杞1,2, 舒冰1,2,* 王擁軍2,*

1. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032 2. 上海中醫藥大學，上海市中醫藥研究院脊柱病研究所，上海 200032 3. 教育部重點實驗室(筋骨理論與治法)，上海 200032

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量低下和骨微結構破壞為特征的全身性代謝性骨病[1]，骨質疏松性骨折(osteoporotic fractures，OPF)是OP患者最為嚴重的并發癥[2]，由于患者具有骨質疏松的病理基礎，導致骨折后愈合時間延長、愈合質量變差、骨形成能力降低[3-4]。預計2050年全球骨質疏松性髖部骨折將有一半發生在亞洲，而中國將有599萬例OPF發生，醫療衛生支出將超過25.4億美金，給我國醫療衛生事業帶來巨大的經濟負擔[5]。OPF患者多為中老年人，常合并其他器官或系統疾病，全身狀況差，易發生并發癥，導致更高的致殘率和死亡率[1]。因此，尋求能夠促進骨質疏松性骨折愈合、縮短療程、減少并發癥的有效藥物具有重要的臨床意義。

根據中醫“腎主骨”理論，補腎中藥是中醫臨床治療OPF的常用藥物，取得了良好的臨床療效[6-7]。齊墩果酸(oleanic acid，OA)是補腎中藥女貞子、墨旱蓮等的主要有效組分之一[8-9]，前期研究[10]發現OA可以呈劑量依賴性的抑制Notch信號通路活性，促進間充質干細胞的早期成骨分化，異位成骨實驗也證明了OA可顯著增加異位骨內骨基質的比例，促進成骨。為了進一步驗證OA是否具有促進OPF愈合的潛在能力，也為了進行給藥方式的優化，避免長期口服服藥的多種局限性，使OA在骨折局部能夠集中持續地釋放，本研究采用微型滲透泵局部緩釋OA的方式，對去卵巢骨折小鼠進行干預，從而觀察OA局部緩釋對OPF愈合的作用，以期為中藥治療OPF提供新的應用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料與儀器：Alzet植入式滲透泵(#1002、#1004，美國Alzet公司，可持續釋放藥物時間分別為14 d和28 d)；齊墩果酸(#O5504，美國Sigma公司)；雌二醇ELISA檢測試劑盒(#ab108667，abcam上海公司)；RNA提取試劑盒(#74104，德國QIAGEN公司)；反轉錄試劑盒(#RR0371A，日本Takara公司)、QPCR試劑盒(#RR820A，日本Takara公司)；阿爾辛藍染液(#A5268-25 G，Sigma上海公司);橙黃G(#O3756-25 G，Sigma上海公司);Micro-CT掃描分析系統(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)；TreadScan被動步態分析儀(GaitScan，美國CleverSys Inc公司)。

1.1.2實驗動物：采用3月齡雌性C57BL/6小鼠，45只，每只體重20 g左右，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心(倫理編號：PZSHUTCM18121414)。采用隨機數字表法，將實驗動物隨機分為假手術組、模型組和OA組，每組各15只。

1.2 方法

1.2.1模型制備：模型組和OA組小鼠行雙側卵巢切除術(OVX)，假手術組僅切除卵巢周圍脂肪組織。術后3個月建立左側脛骨中段骨折模型，小鼠以4 %濃度的異氟烷誘導吸入麻醉，待小鼠進入深度麻醉后，將異氟烷濃度改為2 %維持麻醉。將小鼠側臥位置于操作臺，左后肢備皮，并沿小鼠左側脛骨外側前緣作一約1 cm的縱行切口，分離脛骨周圍筋膜、肌肉，暴露脛骨中段。將1 mL一次性注射器針頭從脛骨平臺前外側沿脛骨長軸刺入脛骨約1.5 cm，把注射器針頭稍退回后剪斷針頭，用迷你電鋸鋸斷脛骨中段，將注射器針頭完全插入脛骨內進行髓內固定，并沿脛骨插入輸藥管釋出端，使輸藥管出口抵達骨折斷端部位。另在小鼠左側肋骨下緣切開表皮，制備長約0.6 cm左右的橫行切口，用血管鉗由切口處皮下沿肋骨向脊柱方向鈍性分離皮下筋膜，撐出1.5 cm×0.8 cm左右膠囊大小的空間。OA組將含有OA工作液的植入式滲透泵植入制備的皮下空間，裁剪輸藥管輸入端并與釋藥棒連接，縫合切口，隔日觀察小鼠飲食和活動情況。通過檢測骨折后小鼠腰椎骨密度和血清雌二醇水平判斷OVX造模是否成功[11]。

1.2.2藥物干預：根據前期研究[10]，20 μmmol/L的OA溶液具有較好的促進骨形成作用，且無細胞毒性，因此取OA粉末9.13 μg溶于1 mL的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液中，配置成濃度為20 μmmol/L的OA工作液，在OA組小鼠的每個滲透泵中注入100 μLOA工作液。假手術組、模型組小鼠的滲透泵內僅注入100 μL的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.3取材、樣本處理：以術后14、28 d作為實驗終點，采用二氧化碳吸入麻醉聯合頸椎脫臼法處死小鼠。常規眼球取血，分離并收集血清。剪開左側脛前皮膚，分離肌肉和筋膜，剪斷肌腱分離脛骨，根據實驗需要將左側脛骨組織、肝臟組織、腎臟組織置入50 mL離心管，10 %中性緩沖甲醛固定液中固定24 h后流水沖洗，之后放于75 %酒精中保存，以備Micro-CT掃描?；驅⑷〔牡淖髠让劰墙M織置入1.5 mL EP管液氮中凍存，于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.4觀察指標

1.2.4.1血清雌二醇檢測：設置標準孔和待測樣品孔，分別加入標準品和待測血清25 μL后再加入200 μL Estradiol-HRP，37 ℃孵育2 h。孵育完成后，吸凈孔內液體，并用300 μL洗滌液，洗滌三次，每孔加入100 μL TMB底物液，室溫中避光孵育30 min，每孔加入100 μL終止液，混勻后，用酶標儀檢測450 nm的吸光度測得數值。

1.2.4.2小鼠步態功能分析：將小鼠放入被動步態分析儀管道，打開跑道開關以10 cm/s的速度運行跑步機，當小鼠在跑道內穩定跑步時，按記錄鍵開始記錄，使小鼠被動跑步20 s，采集整個時期后自動停止。使用步態掃描儀軟件“TreadScanTM2.0”分析小鼠左后肢(骨折側)與右后肢(健側)的平均步態長度和平均邁步時間。

1.2.4.3小鼠脛骨組織、腰椎的Micro-CT掃描進行骨密度測定：取出在75 %酒精中保存的脛骨組織標本放入Micro-CT(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)儀檢測艙，以55 kV電壓、72 μA電流、300 ms/幀速率、10 μm橫斷面厚度斷層成像掃描左側脛骨(脛骨平臺至踝關節之間的部位)和整個第五腰椎標本，對所得圖像進行三維重建，采用Micro-CT評估程序V6.6分析3 D腰椎的骨密度( bone mineral density, BMD)參數。

1.2.4.4小鼠脛骨組織形態學觀察：脛骨組織完成Micro-CT檢測后，放入14 %EDTA溶液中，在搖床上脫鈣21 d，每3天更換EDTA脫鈣液。標本完成脫鈣后經常規脫水、石蠟包埋、切片進行Alcian Blue/Orange G染色，觀察骨痂組織病理學改變。

1.2.4.5骨痂組織成骨相關基因及Notch信號通路靶基因的表達：取出-80 ℃冰箱中的脛骨組織，截取脛骨骨痂組織，研磨后加入Trizol裂解，加入氯仿分層后，加入異丙醇吹打混勻，離心后取沉淀，用75 %酒精洗滌，自然晾干沉淀后以DEPC水溶解沉淀，測定RNA溶液濃度。將RNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)實驗檢測靶基因的表達水平。各基因特異性引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

1.3 統計學分析

使用SPASS 22.0軟件進行統計分析，各組計量資料以均數±標準差表示。對滿足正態性、方差性檢驗的多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠骨折后腰椎BMD與血清雌二醇的比較

與假手術組相比，術后14 d模型組和OA組的腰椎BMD降低(P<0.05)，與假手術組相比，術后28 d模型組血清雌二醇含量下降(P<0.05)，與模型組相比，OA組血清雌二醇含量升高(P<0.05)，表明OVX導致的小鼠骨質疏松模型成立，OA組局部給藥能夠提高OVX后小鼠血清雌二醇含量(表2、圖1)。

表2 各組小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比較

圖1 各組小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比較Fig.1 Lumbar BMD and serum estradiol were compared in each group after fracture注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.2 各組小鼠左側脛骨組織三維重建情況

骨折后14 d，左側脛骨三維重建結果如圖2所示，假手術組骨折線模糊，骨折端有大量骨痂形成，模型組仍有部分骨折線，OA組骨折線模糊；28 d時，假手術組骨折已基本愈合，骨痂較少，模型組骨折部位仍有較大的骨痂，OA組骨折部位骨痂較少。

圖2 各組小鼠骨折后左側脛骨三維重建Fig.2 3D reconstruction of the left tibia of mice in each group after fracture

2.3 各組小鼠骨折后脛骨Alcian blue/Orange G染色結果

各組小鼠骨折術后14、28 d脛骨組織Alcian blue/Orange G染色結果如圖3所示。假手術組骨折端可見大量骨痂和新生軟骨細胞形成，模型組14 d有少量骨痂且骨痂稀疏，骨痂組織中多見脂肪細胞。OA組可見含有軟骨組織的骨痂，且已有大量骨小梁形成。28 d時，假手術組骨折已基本愈合，與假手術組相比模型組仍有較大骨痂，骨折尚未愈合，OA組骨痂體積較小，骨折已接近完成骨痂塑形過程。

圖3 各組小鼠骨折后Alcian blue/Orange G染色結果(×100)Fig.3 Alcian blue/Orange G staining of tibia in each group mice after fracture(×100)

2.4 各組小鼠骨痂組織中Notch信號通路靶基因Hes1和成骨相關基因的表達情況

由于前期研究中，OA具有抑制Notch信號通路，促進骨形成的作用，因此本研究進一步檢測了各組小鼠骨痂組織中Notch信號通路下游靶基因和成骨相關基因的表達水平。

如圖4所示，術后14 d時，與假手術組相比，模型組小鼠骨痂組織中Notch信號通路靶基因Hes1 mRNA表達水平升高(P<0.05)；OA組Hes1 mRNA表達水平低于模型組(P<0.05)。28 d時各組小鼠骨痂組織中Hes1 mRNA表達水平比較差異沒有統計學意義。

圖4 各組小鼠骨痂組織中Notch信號通路靶基因Hes1表達情況Fig.4 Notch signaling pathway target gene Hes1 in bone callus tissue of mice in each group注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

如圖5所示，骨折術后14 d，與假手術組相比，模型組骨痂組織中成骨相關基因Runx 2、OCN、ALP的mRNA表達水平降低(P<0.05)。OA組骨痂組織中Runx 2、OCN的mRNA表達水平均高于模型組(P<0.05)。相較于模型組，OA組骨痂組織中ALP的mRNA表達水平有升高趨勢，比較差異沒有統計學意義。骨折后28 d，與假手術組相比，模型組骨痂組織中Runx 2、ALP和OCN的mRNA表達水平降低(P<0.05)。OA組骨痂組織OCN的mRNA表達水平高于模型組(P<0.05)，但Runx 2、ALP mRNA表達水平與模型組比較差異沒有統計學意義。

圖5 各組小鼠骨痂組織中成骨相關基因的表達情況Fig.5 Expression of osteogenic related genes in callus tissue of mice in each group注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.5 各組小鼠骨折后步態分析

根據上述結果，OA局部緩釋對骨折后14 d時Notch信號通路及成骨相關基因的作用較為顯著，對骨折后14 d時骨痂的愈合過程具有較顯著的促進作用。因此，本研究進一步檢測了14 d時模型組與OA組小鼠進行了后肢步態分析。如圖6所示，骨折術后14 d時，模型組與OA組小鼠左后肢(骨折側)與右后肢(健側)平均步態長度比較差異均沒有統計學意義。模型組小鼠左后肢平均邁步時間顯著高于右后肢(P<0.05)，OA組小鼠左后肢平均邁步時間低于模型組小鼠(P<0.05)，且與右后肢比較差異沒有統計學意義。見表3。

圖6 各組小鼠骨折后步態分析Fig.6 Analysis of gait of mice in each group after fracture注：與模型組右后肢相比，*P<0.05；與模型組左后肢相比，#P<0.05。

表3 各組小鼠骨折后平均邁步時間

2.6 滲透泵藥物釋放時間及OA的肝腎毒性補充結果

如圖7所示，將吲哚青綠注入滲透泵，并將滲透泵移植至骨折小鼠，近紅外觀察吲哚青綠通過輸藥管向骨折局部滲透的時間。結果表明：滲透泵植入72 h后，泵中的液體可到達骨折局部。

圖7 近紅外觀察吲哚青綠在滲透泵中釋放的時間Fig.7 The release time of indolecyan green in pump was observed by NIR

假手術組和OA組小鼠骨折后28 d時肝臟和腎臟組織HE染色結果表明OA局部給藥無明顯肝腎毒性，見圖8。

圖8 各組小鼠骨折后肝臟、腎臟HE染色(×100)Fig.8 HE staining of liver and kidney of mice in each group after fracture(×100)

3 討論

齊墩果酸是中藥女貞子、墨旱蓮的主要有效組分之一，其在抗骨質疏松、骨保護方面的作用已被證實[12]。課題組前期體內外實驗研究表明[13]，OA能夠呈劑量依賴性抑制RANKL介導的破骨形成和功能，抑制OVX導致的小鼠骨丟失。此外，有研究[14-15]表明OA口服能夠促進骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化，提高OVX小鼠的骨密度，改善骨微結構，減少骨丟失。然而目前，中藥治療OPF大多以口服給藥方式為主，其中胃腸道反應是較常見的不良反應，并且還存在長期使用依從性差的問題。其次，口服后藥物進入全身大多數組織器官，不能集中作用于骨修復局部。因此，針對這一問題，本研究采用了Alzet公司的植入式滲透泵作為給藥載體，這是一種可植入實驗動物皮下或腹腔內的滲透壓泵，通過導管以恒定的速度持續準確地輸注測試藥劑，該設備在動物細胞給藥、動物模型建構、藥物及分子篩選、藥理藥代藥效等眾多領域有著廣泛應用[16-17]。通過吲哚青綠近紅外顯影方式，筆者觀察到滲透泵植入72 h后，滲透泵內的液體可以到達骨折局部(圖7)。因此，本研究采用此給藥方式，探討局部緩釋OA對卵巢切除小鼠骨折愈合的作用。

總體來說，OA局部緩釋能夠促進OPF愈合，且相較于28 d，OA干預14 d后的作用更顯著，這可能是因為小鼠骨折術后28 d骨痂已接近塑形晚期，此時破骨細胞的塑形作用更為顯著，且這也與前期體外研究的發現，即OA促進早期骨形成的結論相吻合[10]。從預后功能角度，步態分析顯示，干預14 d后，OA組小鼠左后肢(骨折側)的平均邁步時間顯著低于模型組，說明相同距離內OA組小鼠骨折肢體的接觸地面的次數顯著增加，可以推斷局部給予OA干預14 d時，已經可以改善骨折后肢體的功能活動受限或疼痛感，從而改善去卵巢小鼠骨折肢體的功能恢復。此外，本研究進一步檢測了OA局部緩釋干預28 d后，小鼠肝臟和腎臟組織的組織學變化，未見明顯異常(圖8)。

Notch信號通路是一種在物種進化過程中高度保守的信號通路[18-19]，研究發現阻斷BMSCs中的Notch信號，會導致小鼠骨折延遲愈合或骨不連，但在成骨細胞或軟骨細胞中阻斷Notch信號，則不會出現骨不連，這提示Notch信號通路的激活對于骨折早期BMSCs具有重要作用，而對于骨折中晚期BMSCs成骨、成軟骨分化后沒有顯著作用[20]。進一步研究發現，在間充質干細胞或者軟骨-骨前體細胞中激活Notch信號通路，可以促進細胞增殖，維持其干細胞特性，抑制細胞分化[21-22]；而在間充質干細胞中抑制Notch信號通路，則可以促進干細胞的分化，進入成骨或成軟骨狀態[23-24]，由于BMSCs在骨折愈合中扮演者重要的角色，其介導的骨形成亦是骨折愈合過程中的重要病理環節[25-26]。因此，結合骨折愈合的病理過程規律和Notch信號通路的作用特點，在骨折早期階段，需激活BMSCs中的Notch信號通路，從而促進BMSCs的增殖；而在骨折急性期后，需要抑制BMSCs中的Notch信號通路，從而促進BMSCs的分化和骨形成。

Hes1是Notch信號通路的重要靶基因之一[27]。本研究顯示，與模型組相比，OA局部緩釋14 d后，可以顯著降低骨痂組織中Hes1 mRNA的表達，提高骨形成相關基因的表達水平。前期體外研究已經證明，OA可以通過抑制Notch信號通路促進BMSCs的成骨分化，本研究從體內實驗的角度驗證了OA能夠抑制去卵巢小鼠骨折14 d時Notch信號通路下游靶基因Hes1的表達，促進骨形成相關基因的表達。而在骨折28 d時，假手術與模型組骨痂組織中Hes1 mRNA的表達水平未見顯著差異，這再次驗證了Notch信號通路的激活對于骨折早期BMSCs具有重要作用，對BMSCs成骨、成軟骨分化后作用并不顯著。而OA局部干預28 d時，其對Notch信號通路作用不顯著，同時對成骨相關基因表達水平的增強作用亦有所減弱。因此，OA局部緩釋可能通過抑制骨折愈合早中期局部BMSCs中的Notch信號通路，促進BMSCs的成骨分化，加速去卵巢小鼠的骨折愈合。而當BMSCs分化為成熟的成骨或成軟骨細胞，骨折愈合接近末期，由于Notch信號通路活性較低，OA對Notch信號通路也無顯著抑制作用。

綜上所述，OA局部緩釋能夠促進去卵巢小鼠的骨折愈合，這可能與其抑制骨折愈合早中期BMSCs中Notch信號通路、上調成骨相關基因表達的作用有關，同時該研究也為中藥治療OPF提供了新的應用途徑和理論依據。此外，OA還具有抗氧化、抗炎調節免疫等多種作用[9]，活性氧、炎癥等均是影響骨代謝的重要因素[28-29]，因此OA局部緩釋促進小鼠骨質疏松性骨折的愈合，是否與其抗氧化、調節免疫等作用有關，仍需今后進一步研究探索。