骨質疏松中的自噬相關信號通路

邵家豪 李超張賢

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023 2.南京中醫藥大學無錫附屬醫院，江蘇 無錫 214071

骨質疏松癥(osteoporosis)在當下人口老齡化問題日趨嚴重的情況下儼然成為了亟待解決的社會公共健康問題，其最大的特征就是骨量的丟失、骨微觀結構的改變。這種改變的產生主要是成骨細胞和破骨細胞功能動態平衡失調使得骨穩態失衡導致的[1]。近年來，大量研究發現自噬在維持成骨細胞和破骨細胞正常生理功能方面具有重要作用，自噬既能夠參與到破骨前體細胞向破骨細胞分化時線粒體活性氧的生成[2-3]，又能夠促進成骨前體細胞向成骨細胞分化的過程[4]，在對骨質疏松模型大鼠的自噬相關基因Atg7失活研究[5]中發現當自噬的關鍵啟動基因Atg7[6]被失活，即抑制自噬時會導致破骨細胞分化的降低從而導致體外骨吸收的降低，這些都證明了我們自噬與骨質疏松的發生發展具有密不可分的關系。本文就自噬的信號通路在骨質疏松癥方面的研究進展進行綜述，希望為進一步探究自噬信號通路的內在調控機制，選擇適當的干預靶點，充分發揮自噬對成骨、破骨細胞的有利調節作用，為臨床上治療骨質疏松癥提供新的思路。

目前已知的關于骨質疏松的相關通路主要集中在Wnt/β-catenin信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、Notch信號通路、PPAR-γ信號通路等，同樣針對骨質疏松癥的自噬信號通路研究也是復雜多樣的。就目前來看調控自噬的信號通路與參與骨代謝的信號通路并不是完全獨立的，相互之間也有著緊密聯系，各信號通路上、中、下游之間的傳導關系往往也是錯綜復雜，各條通路之間看似相互平行，實則有可能是交叉重合，看似方向背道而馳，實則卻又起著共同的作用，與骨質疏松有關的自噬通路的研究對于整個自噬通路來說可能還只是冰山一角，目前關注較多的主要還是以接下來的通路為主。

1 PI3K/AKt/mTOR信號通路

磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinosital-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是經典的自噬信號通路之一(以下簡寫成PI3K/Akt/mTOR)，該通路主要是由上、中游信號轉導通路PI3K/Akt和下游效應分子mTOR組成，最上游的PI3K分子參與到細胞的存活、生長、代謝、分化的過程并占據重要作用，調節細胞內蛋白分子的活性[7]，是一類相互協作，目標一致的分子大家族，為接下來的所有位于其下游的分子信號轉導提供幫助，而AKt作為PI3K的下游效應分子，在整條PI3K/Akt/mTOR信號通路中位于中游位置，起到承上啟下的效應作用，受到激活而磷酸化的Akt分子可以影響到位于其下游多個效應分子的活性，進而影響到整個細胞周期的進程、蛋白質合成、自噬整個過程的進行，PI3K/Akt的活動在整個自噬信號通路中的地位相當于一把關鍵性的“鑰匙”。最下游效應分子mTOR是Akt的重要底物，并且mTOR分子歸屬于PI3K分子大家族，能夠接受并且響應各種信號，正因為這一特點，mTOR在整個自噬信號傳導通路中充當“集合點”的作用[8]，不僅PI3K/AKt上游信號通路最后都將匯聚到mTOR這一處，其他自噬調控通路的上游通路的信號傳導也都將在mTOR這個“集合點”匯合。就目前研究進展來看PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條自噬調控過程中已知的明確的對自噬是抑制性的通路，活化后可以用來抑制自噬，保護細胞免受凋亡；相反，抑制該通路可以誘發自噬使細胞進入凋亡流程[9]。

張森等[10]利用抑制劑對成骨細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路進行抑制，發現被抑制信號通路之后成骨細胞中線粒體功能明顯下降，這說明PI3K/Akt/mTOR信號通路在維持成骨細胞正常生存中扮演著重要的角色。成骨細胞的主要功能是參與骨的形成，Mukherjee等[11]研究發現在成骨細胞分化和功能的所有階段都需要Akt活性，成骨分化是一個多步驟的過程，這些步驟中都可能存在Akt的作用靶點，正是這些靶點操控著成骨細胞的分化方向和進程。這些研究都表明PI3K/Akt/mTOR信號通路參與到成骨細胞的分化過程，并且在整個分化過程中，甚至起到了類似于“方向盤”的把控作用。Xi等[12]用大鼠骨質疏松癥模型和培養的成骨細胞模型研究PI3K/Akt信號通路，在體內、體外實驗的結果都表明PI3K/AKt信號通路可以通過促進成骨細胞的增殖、分化和骨形成來對骨質疏松的發生與發展產生抑制作用。

PI3K不僅對成骨細胞有積極作用，對破骨細胞也有著特殊的作用。Fu等[13]研究表明，在糖皮質激素誘導的骨量丟失的情況中，破骨細胞的自噬過程會出現增強，而PI3K/Akt/mTOR信號通路參與介導了這一過程，甚至在Hall等[14]的實驗中發現在PI3K信號通路參與了破骨細胞骨吸收時所需的小泡胞外分泌和皺褶邊界膜形成的過程，并且抑制該通路已被證明可以阻止成熟的破骨細胞進行骨吸收。這些實驗結果都表明PI3K參與到了破骨細胞生成和發揮功能的過程中。總而言之，PI3K/Akt/mTOR信號通路在成骨細胞和破骨細胞的分化、增殖的過程中起到了不可或缺的作用，破骨細胞對應了骨的吸收，能夠消除舊的骨，成骨細胞對應了骨的形成，能夠生成新的骨替代被吸收的骨組織，當骨吸收能力超過骨形成能力時，骨的穩態就被打破，出現“入不敷出”的情況，骨質疏松也將緊隨其后，只有當二者相輔相成，相互協調平衡，骨穩態方能正常維持，這都有賴于PI3K/Akt/mTOR這條信號通路的正常傳導。

2 AMPK/Akt/mTOR信號通路

腺苷單磷酸激活的蛋白激酶(AMPK)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路(以下簡稱AMPK/Akt/mTOR)主要是與人間充質干細胞(BMSCs)向成骨細胞分化的過程有關。首先，AMPK是一種真核細胞內重要的能量傳感系統，負責維持ATP能量產生與消耗之間的平衡，當細胞內的AMP/ ATP比值增加時，AMPK就會開始干預細胞內的能量流動，激活能量的產生途徑并且關閉能量的消耗途徑來保存細胞內的能量[15-16]。Aleksandar 等[16]的研究發現，即AMPK能夠通過早期mTOR抑制介導的自噬和Akt/mTOR信號轉導軸的后期激活來控制人間充質干細胞的成骨分化。Zhang等[17]的研究發現在激活AMPK時可以誘導成骨細胞的自噬，在這個過程中LC3B的表達會增高，成骨細胞分化和礦化能力會加強，而細胞外基質的礦化對成骨細胞的功能成熟具有重要意義，并且在使用3-MA抑制成骨細胞自噬過程時，成骨分化相關標志物如Runx2等的表達會有所下降，這說明AMPK的活化能夠使自噬對成骨細胞的骨形成的過程產生促進作用[18]。在整個人間充質干細胞的成骨分化過程涉及到的AMPK/AKt/mTOR信號途徑與自噬的作用機制是復雜的，按照時間順序來看，首先是AMPK信號途徑中成員的活化以及自噬的誘導，隨后才是Akt和mTOR的晚期活化，成骨分化過程的早期是需要AMPK介導的自噬參與，目的是為了使間充質干細胞達到最佳的成骨分化狀態，接下來才是Akt進行磷酸化，并通過Akt承上啟下的作用在成骨分化的后期來啟動自噬負調控因子mTOR的激活開關。及時協調的AMPK依賴性自噬和Akt /mTOR通路的活化在人間充質干細胞向成骨細胞分化過程中的具有潛在重要性。

3 ERα-AMPK-Sirt1信號通路

沉默信息轉錄調節因子1(SIRT1)在抑制腫瘤、維持線粒體穩態、能量代謝、細胞衰老以及細胞死亡等多種生物學功能的調控中發揮著重要的作用，楊旭浩[19]在關于SIRT1調控骨質疏松模型大鼠的成骨細胞線粒體自噬中的作用研究發現SIRT1的缺失會導致骨量的減少，而當其基因過表達時會出現骨量的增加，在Kim等[20]相關研究中發現Sirt1 能通過破骨細胞譜系細胞中的直接作用抑制骨吸收。AMPK與Sirt1之間相互作用主要體現在Sirt1可以通過對LKB1分子的去乙酰化修飾來輔助增強AMPK的表達進而引發自噬，相關研究[21]表明，AMPK被抑制后，成骨細胞凋亡數量會增加，再進一步沉默AMPKα后，成骨細胞的凋亡效應更加明顯，可見Sirt1 / AMPK 的正常激活對于成骨細胞的存活起到至關重要的作用。總的來說，目前對于ERα/AMPK/Sirt1這條信號通路還是構建在AMPK作為自噬的關鍵調節因子的基礎上，AMPK的激活可以直接誘發自噬的過程，也可以通過抑制mTOR相關表達來間接誘發自噬的產生。對于ERα/AMPK/Sirt1信號通路的研究才剛剛開始，有許多未知在等待我們去探索。

4 ROS信號轉導通路

活性氧類(ROS)是一類化學性質活潑、具有較高氧化活性的分子和離子的總稱，是需氧細胞代謝過程中產生的活性氧簇，主要包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮等。ROS通過細胞氧化應激反應能夠誘導細胞產生凋亡甚至導致細胞的壞死[22]，是氧化應激反應中關鍵信號分子，并且 ROS 還能在許多信號通路(包括 MAPK 和 NF-κB)的調控中充當第二信使[23]。線粒體既是細胞的能量工廠同時又是ROS產生的主要部位，相關研究[24]表明，ROS作為一種重要的信號分子，可以啟動自噬體形成和自噬降解，起到細胞信號分子的作用[25]，參與細胞增殖、分化、凋亡、自噬等多個生理過程，尤其是線粒體來源的ROS，在自噬發生的過程中發揮重要作用，當大量ROS類分子在線粒體內蓄積，可引起線粒體膜脂質過氧化，導致線粒體功能異常，進而誘導自噬產生[26]，當自噬激活后又可通過降解過氧化氫酶更進一步地增加細胞內ROS的水平，最終引起自噬性細胞死亡的不良結果。SIRT3作為一種重要的線粒體蛋白，可通過穩定線粒體膜電位的方式來保持線粒體的正常功能來抑制氧化應激并減少活性氧(ROS)的產生，Gao等[27]研究證明SIRT3/SOD2途徑可通過調節線粒體應激來維持成骨細胞分化和骨骼形成。Jin等[28]關于唑來膦酸治療骨質疏松的相關研究發現，H2O2分子含量變化可誘導成骨分化相關基因表達的下調。同時，H2O2分子的相關變化還會導致骨髓間充質干細胞的堿性磷酸酶活性和礦化能力的下降，進而影響到骨髓間充質干細胞向成骨分化的過程，王嘯等[29]在關于高鐵環境下的破骨細胞分化情況的研究中發現在高鐵環境下ROS水平升高，能夠促進破骨細胞的分化,

5 NF-κB信號通路

NF-κB是哺乳動物體內調控細胞的增殖、分化、炎癥過程中的重要轉錄因子，其能夠參與機體的炎癥反應、免疫應答及其他應激反應[30]。最新的研究發現，隨著衰老的進展，體內糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)會逐漸堆積，而AGEs的堆積可以激活核因子-κB(NF-κB)信號通路并引發氧化應激氧化反應，這種通路機制被認為與組織衰老退化有關。自噬可以通過調控該信號通路，促進成骨分化、提高礦化能力，利于骨形成。在關于NF-κB信號通路的研究[31]中發現，喪失NF-κB信號功能的小鼠會顯示出以骨量減少為特征的骨質疏松癥。NF-κB激活對于破骨細胞的骨吸收功能至關重要，當細胞受到相關氧化應激反應的炎性物質刺激時，NF-κB 信號轉導通路將會被激活，進而促使組織蛋白酶K( cathepsin K，CatK)、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)等與破骨方面有關的特異性基因的表達有所升高，在宏觀上就表現為破骨細胞數量增多，骨吸收能力的增強，骨密度的下降[32]，所以若要糾正骨質疏松過程中破骨細胞強勢的情況時，可以考慮抑制該信號通路，如此能夠在一定程度上對破骨細胞進行抑制起到糾正破骨細胞與成骨細胞不平衡關系的作用。NF-κB信號通路的受體活化需要p62，具體指p62與TRAF6相互作用并通過非典型蛋白激酶C介導的破骨細胞中IκB激酶(IKK)的活化來激活NF-κB信號通路。此外，NF-κB信號通路可以控制間充質干細胞向成骨分化的過程，NF-κB活性功能的表達能夠阻止成骨分化，自噬過程中的p62信號傳導可以通過減弱自噬活性進而減弱IκB激酶/核因子-κB(IKK/NF-κB)這條經典NF-κB信號通路的活性表達，反過來促進成骨細胞分化。

p62，也稱為sequestosome1，是自噬和泛素-蛋白酶體系統控制泛素化蛋白質更新的主要調節劑，可轉運多泛素化蛋白，用于蛋白酶體和溶酶體降解的過程中[33], 充當著自噬適配器的作用，p62能夠識別多聚泛素鏈并與 LC3 相互作用，將選定的貨物靶向自噬體，從而開啟自噬降解的運轉流程。除此功能外，p62還可以在多種信號通路中充當信息的交換中心，包括Nrf2、NF-κB、caspase-8和mTORC1介導的信號傳導途徑，正因為p62涉及到了多條信號通路，p62這個蛋白能夠在控制氧化應激、炎癥和細胞存活、細胞凋亡以及代謝重組過程中起到至關重要的作用[34]，在自噬過程中，p62與泛素化的蛋白質結合，再與定位于自噬小體內膜上的LC3-II蛋白形成復合物，一同在自噬溶酶體內降解。因此，當出現自噬時，在細胞質中p62蛋白不斷被降解，當自噬出現活性減弱、功能缺陷時，p62蛋白會在細胞質中不斷累積，p62是反映自噬活性的標記蛋白之一，因此p62在破骨細胞形成中也起著核心作用。

綜上所述，骨質疏松癥是一種骨骼代謝平衡失調性疾病，由于骨骼重塑過程中成骨細胞、破骨細胞功能表達的失衡，尤其以破骨細胞介導的骨吸收功能的過度表達導致骨骼質量低下和骨折風險增加，因此目前針對破骨細胞的強勢功能表達這一不平衡的情況已經通過開發抗吸收劑來作為骨質疏松癥治療的主要方向[35]，對于自噬在骨質疏松方面相關信號通路的研究主要還是集中在以mTOR為主要“中轉站”的信號通路為主，就目前的研究中最為集中也最為深入的是PI3K/Akt/mTOR信號通路，利用這條通路來調控自噬進而促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化以及成骨細胞和破骨細胞的生理代謝和功能表達是目前比較清晰的方向。自噬在細胞的損傷機制中起到了類似于“雙刃劍”的作用，當從有利的方面來看，自噬是體內平衡的重要調節系統，既可以降解錯誤折疊起來的蛋白質，又可以選擇性地靶向降解受損的細胞器來抑制細胞的凋亡[36]，還可以參與到細胞的凋亡過程[37]，當從不利的方面看，自噬時間延長時，基本穩態和細胞存活所必需的蛋白質和細胞器就會被過度降解，從而導致細胞死亡(自噬細胞死亡或II型程序性細胞死亡，PCD II)，因此，從自噬對細胞降解的程度來看，自噬既是細胞存活機制又是細胞死亡途徑[38]。AMPK作為自噬的關鍵調節因子，如果想要更進一步地把握自噬的機制，AMPK相關信號通路的研究是不可錯過的重頭戲。AMPK/Akt/mTOR信號通路在調控自噬與成骨分化之間的關系具有復雜的時間依賴性和雙向調節性，筆者認為研究成骨過程中早期AMPK依賴性自噬和后期的Akt/mTOR通路活化之間的關系，并且利用這個關系來調控成骨的過程是值得進一步深入研究的方向。