Wnt/β-catenin信號通路在脊柱小關節骨性關節炎中的作用

王嘉琦 江華

廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科，廣西 南寧 530021

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種多因素相互作用導致關節軟骨完整性受損，累及軟骨下骨和關節邊緣骨贅形成的關節疾病。遺傳因素和環境因素在OA的疾病進程中扮演著重要角色[1]。近年的研究[2-3]表明，Wnt/β-catenin信號通路可能通過調節關節組織中的軟骨細胞、成骨細胞和滑膜細胞的功能，在OA發病機制中發揮著獨特作用。

脊柱作為人體的承重支柱，其后部連接上下椎體的小關節是骨性關節炎的高發部位。脊柱小關節成對位于脊柱后部，是連接相鄰脊柱功能單位之間的唯一滑膜關節。在解剖結構上，脊柱小關節由相鄰椎體上下關節突以及周圍的軟組織構成關節囊和滑膜，軟骨覆蓋于關節面，滑液填充于關節腔內；在生物力學上，脊柱小關節獨特的解剖結構使其承受脊柱重力，協助脊柱完成前屈和后伸，同時限制脊柱水平方向的旋轉。脊柱小關節發生骨性關節炎的原因和膝關節骨性關節炎類似，均與其特殊的結構和功能密切相關。主要表現為軟骨的減少、變薄和軟骨下骨硬化，軟骨細胞肥大、聚集和凋亡增加，骨贅形成，且伴隨基質蛋白多糖的減少。同時，患者軟骨下骨組織中出現廣泛骨形成和血管形成，炎性細胞浸潤和破骨細胞活動增強。炎性細胞浸潤導致包括生長調節致癌基因α(GROα)、可溶性血管細胞粘附分子1(sICAM-1)、干擾素γ、白介素IL-1β、IL-17、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1α和IL-17E等促炎因子增加，以及IL-10和IL-13等抗炎因子增加[4]。脊柱小關節骨性關節炎可能不引起椎間盤的退變，而椎間盤退變可能引起脊柱小關節骨性關節炎，因為椎間盤退變改變了脊柱運動節段的生物力學效應[5]。既往研究[6]證實，通過Wnt/β-catenin信號通路相關途徑可誘發脊柱小關節骨性關節炎和椎間盤退變。

1 Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin信號通路是一組信號轉導途徑，由下列成分組成：配體wnt蛋白、胞膜受體七次跨膜卷曲蛋白(Frizzled)受體家族、低密度脂蛋白受體相關蛋白5、6 (LRP5/6)、Dvl蛋白、支架蛋白Axis抑制蛋白1、2(Axin-1、Axin-2)、酪氨酸激酶1(CK1)、GSK-3β激酶、APC蛋白組成的多蛋白復合體、β-catenin和下游的雙向轉錄因子TCF/ LEF等[7-8]。

典型Wnt/β-catenin信號通路是由wnt蛋白觸發的細胞內信號通路，通過胞膜受體和多蛋白復合體調節β-catenin在細胞內的濃度以及分布情況，從而影響細胞核內轉錄因子，以實現調控下游基因的轉錄與表達。在wnt蛋白處于靜止狀態時，β-catenin在細胞內的含量維持在穩定水平，過量的β-catenin被26 S蛋白酶泛素化且被降解。由Dvl蛋白、支架蛋白Axis抑制蛋白1、2(Axin-1、Axin-2)、酪氨酸激酶1(CK1)、GSK-3β激酶以及APC蛋白組成的破壞復合體介導了這一過程。破壞復合體磷酸化β-catenin上特定的氨基酸殘基，從而啟動β-catenin的降解過程，而β-catenin基因外顯子3負責編碼這一特定的氨基酸殘基。因此，抑制β-catenin的磷酸化或沉默β-catenin基因外顯子3即能阻止β-catenin的降解過程。當wnt結合到作為配體的卷曲蛋白和LRP5/6后，卷曲蛋白和LRP5/6的胞內部分與Dvl蛋白、Axin-1/Axin-2以及APC蛋白發生相互作用，使β-catenin從破壞復合體中釋放出來，從而使胞內和核內的β-catenin含量升高。β-catenin在細胞核內與雙向轉錄因子TCF/ LEF結合，激活wnt蛋白目標基因的表達[7]。Wnt/β-catenin信號通路高度保守，參與調節各種細胞的活動，在生長發育過程中起著關鍵作用[9]。

2 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑

Wnt/β-catenin信號通路抑制劑包括兩大類，一類是分泌型卷曲蛋白相關蛋白家族(secreted frizzled-related protein family，sFRPs)以及wnt抑制因子1(wnt inhibitory factor-1，WIF-1)，其中sFPR3是其代表，這類抑制劑主要與wnt蛋白結合以影響wnt蛋白與受體結合的能力。另一類是DKK(dickkopf)家族，主要通過與LRP5/6結合來影響Wnt/β-catenin信號通路，它還和骨性關節炎發生的風險密切相關[10]。硬化蛋白(sclerostin , SOST)和DKK1蛋白(dickkopf-1)能與wnt蛋白的受體LRP5/6結合，從而抑制wnt蛋白與LRP5/6的結合和信號傳導。其機制可能是硬化蛋白和DKK1均結合至LRP5/6的第一個β螺旋，使wnt-1的信號傳導受到抑制；DKK1還能結合到LRP5/6的第三個β螺旋以抑制wnt3a的信號傳導[7,11]。

3 骨性關節炎中的Wnt/β-catenin信號通路

在人類OA遺傳基因研究中，與Wnt/β-catenin信號通路相關的基因突變常常被認為是OA的重要易感基因。編碼sFRP3的基因sFrp3中羧基末端arg324gly發生替換后，可導致承重關節OA發生率增加[12-13]。Nakamura等[14]在OA患者關節軟骨、骨和滑膜組織的基因檢測中發現，與wnt基因相關的wnt7b在OA發病過程中發揮重要作用。Blom等[15]發現WISP-1(Wnt1誘導信號通路蛋白1)表達在OA患者的組織標本和小鼠動物模型均出現升高。此外，在OA患者體內，Wnt/β-catenin通路的拮抗劑DKK1在血漿和滑液中的表達水平均較正常人群明顯降低，且與OA影像學分級的嚴重程度呈負相關關系[16]。

Chan等[17]發現在小鼠和羊的OA動物模型以及OA 患者的軟骨中，Wnt/β-catenin通路的抑制劑-硬化蛋白的表達升高。在OA動物模型的軟骨移植治療中，使用硬化蛋白能抑制Wnt/β-catenin信號通路的傳導，其原理可能是通過降低Mmp、Adamts、Acan和Col2a1基因的表達，進而降低IL-1α介導的聚糖蛋白溶解以實現抑制分解代謝。相反，在OA動物模型發生骨硬化的區域中，硬化蛋白顯著減少。因此，硬化蛋白在骨贅形成過程中的表達反映了其在抑制Wnt/β-catenin通路介導的軟骨下骨形成過程的調節機制[18]。

在目前關于OA的研究中，采用了很多不同的動物造模技術，包括自發、手術、化學誘導以及基因敲除等。在自發OA的小鼠(str/ort小鼠)和膠原酶誘導OA的小鼠模型中，其關節軟骨和滑膜中的Wnt基因以及其相關基因的表達水平均發生明顯變化。例如，WISP1的表達水平顯著升高，WISP1具有調節軟骨細胞和巨噬細胞中MMPs和聚集酶表達的作用，并可誘導關節軟骨的降解[15]。此外，sfrp3基因敲除的小鼠更容易被手術或化學誘導而出現OA表型[19-20]。同時，sfrp3在軟骨細胞成熟和長骨發育的調節過程中還發揮著重要作用[21]。上述結果均表明了Wnt/β-catenin信號通路的激活在OA發生和進展過程中具有重要意義。

基于OA小鼠模型探究Wnt/β-catenin信號通路在OA病理生理過程中的作用是十分重要的。在β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠模型中，β-catenin外顯子3被敲除后，使其產生穩定融合蛋白，對GSK-3β磷酸化以及隨后的泛素化和蛋白酶體的降解都具有抑制作用。由于β-catenin的降解被抑制，導致了關節軟骨細胞核內的β-catenin水平升高，從而導致出現關節軟骨的逐漸減少和骨贅的形成等OA表型。在β-catenin(ex3)Agc1CreER小鼠模型中，同樣出現了類似的情況。Zhu等[2]證實了β-catenin在胞內表達水平過高可導致關節軟骨出現OA表型 。反之亦然，β-catenin在胞內水平過低也會導致關節軟骨出現OA表型。TCF抑制劑(ICAT)是一種通過結合β-catenin特定結構，進而抑制β-catenin與核內TCF相互作用的細胞內蛋白。在Col2-ICAT轉基因小鼠模型中，β-catenin信號通路在軟骨細胞中被特異性抑制，導致生長板軟骨細胞發育緩慢以及關節軟骨退變[22-23]。這一系列的發現都表明，Wnt/β-catenin信號通路在OA發展過程中發揮了關鍵作用，維持正常的軟骨細胞功能需要胞內的β-catenin處于穩定而適當的水平，過高或過低的β-catenin水平均會導致OA的發生與發展。

在OA病變初期，均會出現軟骨細胞代謝率降低以及軟骨細胞的肥大和凋亡[24]。此時，關節軟骨細胞內顯示軟骨特異性的基因，如Col2a1和aggrecan等均出現表達水平降低；反映細胞肥大的標記基因如Runx 2和Col10a1等均出現表達升高；編碼分解代謝酶的基因，如Mmp13、Adamts4和Adamts5等均出現表達升高[25-26]。軟骨細胞中代謝組分合成的減少，分解代謝酶合成的增加，最終導致進行性軟骨纖維化和退化。軟骨下骨改變和骨贅形成均可出現在OA的進展過程中，通過調控Col2a1或Agc1基因的表達，條件性激活β-catenin信號的轉基因小鼠可出現嚴重的軟骨退變、軟骨下骨侵蝕和骨贅形成[6]。上述研究證明了軟骨細胞中表達的wnt和β-catenin相關蛋白可引發不同的細胞反應，直接或間接的影響OA表型的出現。

4 脊柱小關節骨性關節炎中的Wnt/β-catenin信號通路

在β-catenin(ex3)Col2CreER轉基因小鼠模型和β-catenin(ex3)Agc1CreER轉基因小鼠模型中，對2周齡的實驗小鼠應用他莫昔芬，在3個月、6個月和9個月時對小鼠模型的脊柱小關節進行評估，結果發現在每一個時間節點上，小鼠的脊柱小關節均出現明顯的退變。組織學分析顯示，脊柱小關節OA和椎間盤退變是同時發生的[27]。上述研究證實，調控Wnt/β--catenin信號通路可誘導脊柱小關節OA和椎間盤退變。

MMP13是參與軟骨降解過程中最重要的金屬基質酶之一，而在OA患者的軟骨細胞中MMP13亦呈現高表達[25]。Neuhold等[28]發現在Mmp13基因過表達的小鼠中可出現關節軟骨退變的癥狀。Wang等[29]在Mmp13條件性基因敲除小鼠模型中發現，關節軟骨體積和軟骨基質分泌增加，軟骨細胞凋亡減少；應用特定的MMP13抑制劑可減輕OA表型的嚴重程度。同時進一步敲除β-catenin基因外顯子3和Mmp13基因，可獲得雙突變的β-catenin(ex3)/Mmp13Col2CreER小鼠模型，表現為β-catenin高表達和Mmp13缺失。在此類小鼠模型中發現，由β-catenin條件性激活所導致的關節退變以及退變產生的疼痛均得到顯著緩解，進一步證實MMP13在脊柱小關節骨性關節炎的退變中具有關鍵的效應。在β-catenin(ex3)Col2CreER|Adamts5-/-雙突變小鼠中，Wang等觀察到了類似的脊柱小關節退變的緩解效應[27,30]。Mmp13或Adamts5的缺失可顯著逆轉β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠的脊柱小關節和椎間盤退變。ADAMTS蛋白酶家族在OA進程中具有促進蛋白聚糖和聚蛋白聚糖消耗的作用。在β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠模型中，β-catenin過量表達可導致椎間盤組織Adamts4和Adamts5基因的表達亦出現升高。在OA小鼠模型中，敲除Adamts5基因或雙敲除Adamts4和Adamts5基因的可有效防止軟骨退化[26,31]。上述研究提示在基因水平上對金屬基質酶等進行調控，可為脊柱小關節骨性關節炎的未來治療策略奠定理論基礎。

5 小結

隨著對骨性關節炎研究的深入，其發生和發展過程日益得到重視。脊柱小關節骨性關節炎作為骨性關節炎中的典型代表之一，其發病機制與其他類型的骨性關節炎十分類似，如軟骨退變、軟骨下骨塌陷和骨贅形成等。目前，關于脊柱小關節骨性關節炎的研究廣泛涉及生物力學、分子生物學等方面。Inoue等[32]通過觀察脊柱小關節在不同負荷條件下的生物力學功能，提出了脊柱小關節骨性關節炎的誘因和疼痛的新解釋。Nakamura等[33-34]通過對脊柱小關節骨性關節炎軟骨進行高通量miRNA篩選，發現miR-181a-5p和miR-4454與脊柱小關節骨性關節存在相關性，進一步證實miR-181a-5p能通過促進軟骨細胞凋亡和分解代謝使小關節面軟骨變性、退變。Chen等[35]運用生物信息學方法發現Wnt/β-catenin信號通路深度參與脊柱小關節退變的病理生理過程。Wnt/β-catenin信號通路在骨性關節炎的病理生理過程中具有重要作用，其相關蛋白參與骨性關節炎的各種調節機制。然而，Wnt/β-catenin信號通路是如何激活的，是否還受到其他因素的調節，以及其如何參與軟骨細胞、破骨細胞及成骨細胞的重塑機制等問題尚未完全明確，這也將是未來需要繼續探索的重要方向之一。