長鏈非編碼RNA的中醫藥治療骨質疏松癥研究進展

林若慧 李生強 陳娟 謝麗華 葛繼榮

1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122 2.福建省中醫藥科學院基礎研究所骨質疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350003

骨質疏松癥是一種以骨量丟失，骨組織微小結構破壞，引起骨強度下降和骨脆性增加為特征的全身代謝性疾病，臨床上多見于絕經后婦女。中醫認為骨質疏松癥屬于“骨痿”等范疇，祖國醫學辨證治療及預防骨質疏松癥具有明顯的優勢甚至效果顯著，但中醫理論指導下中醫藥治療骨質疏松癥的分子機制仍不明確。骨質疏松癥分子生物學的研究發展為OP的中醫藥治療研究開辟新的思路，這對臨床上中醫藥的廣泛應用具有重要指導意義。長鏈非編碼RNA是近年來的研究熱點，是控制多種基因表達以及參與多種生物學過程的重要表觀遺傳調控因子。越來越多的研究表明，lncRNAs在骨質疏松癥、骨關節炎等疾病的部分中醫證型中差異性表達[1]，中藥調控lncRNA干預治療骨骼疾病也逐步成為醫學領域的熱點。因此，本文基于lncRNA總結近年來中醫藥治療骨質疏松癥的研究進展，進一步表明lncRNA在骨質疏松癥中醫藥治療的分子機制中的研究價值，為臨床實踐提供堅實的理論基礎。

1 lncRNA簡介

lncRNA即長鏈非編碼RNA，是長度大于200個核苷酸、不被翻譯成蛋白質的一類功能性RNA分子，最早被發現具有誘導蛋白結合影響靶點活性，影響mRNA轉錄或構成細胞結構成分等功能[2]。研究表明，某些lncRNAs參與了人類疾病的發病機制，如骨代謝疾病、癌癥、心血管疾病等[3]；并且與細胞周期、干細胞分化等生物進程相關[4-5]。同時，越來越多證據表示lncRNA 在基因調控上的重要作用，分別為表觀遺傳調控、轉錄及轉錄后水平影響基因表達[6-7]。

2 骨吸收-骨形成過程中lncRNA的表達

骨骼的完整性由不斷重復的動態“骨重建”維持[8]，而骨重建由成骨細胞(osteoblasts，OB)、破骨細胞(osteoclast，OC)和骨細胞等組成的骨骼基本多細胞單位實施。隨著年齡增加，骨吸收則大于骨形成，引起骨代謝失衡導致骨質疏松。lncRNA參與了骨質疏松癥骨代謝失衡的動態過程，主要涉及成骨細胞、破骨細胞分化和調控，并在骨代謝相關信號通路中有重要的調節作用。

研究表示lncRNA-H19、lncRNA-HIF1α-AS1[9]、lncRNATUG1[10]、lncRNAMEG3[11]、lncRNAMALAT1[12]等可能參與了成骨細胞的增殖過程。其中lncRNA-H19[13]則是通過靶向miR-675間接誘導成骨細胞增殖，同時充當競爭性內源RNA[14]激活Wnt信號傳導促進成骨細胞分化；此外，lncRNA-H19、lncRNAMEG3和lncRNATSIX[15]通過miRNA間接減弱成骨細胞的增殖。RUNX2轉錄因子是促成骨分化通路中的關鍵因子，有研究表明lncRNA ANCR[16]與EZH2特異性結合能促進Runx2表達從而促成骨分化。

在破骨細胞功能和骨吸收過程中，lncRNA調控的信息較少。洪宇桁等[17]認為lncNEAT1促進破骨細胞分化并抑制成骨細胞分化；另有Dou等[18]對破骨細胞形成各個階段lncRNA、mRNA、circRNA和miRNA的表達譜進行了微陣列分析，構建了相應的共表達網絡，為lncRNA在OC發生過程中發揮的潛在功能提供系統性的觀點。Liu等[19]驗證了lncRNAAK077216的表達在破骨細胞發生過程中顯著上調，提示AK077216抑制NIP45的表達，且調節NFATc1的表達從而促進破骨細胞的形成和功能。Han等[20]發現，與健康人群相比，LncRNA TUG1在骨質疏松癥患者血清中表達更高，過表達 LncRNA TUG1促進破骨細胞的增殖及抑制凋亡；采用siRNA敲低則取得了相反的結果，表明敲低LncRNA TUG1可能成為一個骨質疏松治療的潛在靶點。此外，lncRNA還被發現參與調節細胞因子[21-22]、骨代謝相關信號通路[23]發生過程。

3 OP不同中醫證型lncRNA的差異表達

中醫將OP歸入“骨痿”、“骨痹”等病癥范疇，并且認為其發生與腎、脾和肝等臟腑功能密切相關。《素問·痿論》：“骨主身之骨髓，腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”言之本在腎，病在骨。若稟賦素弱，或久病及腎，或年老腎氣漸衰，皆可致腎氣虧虛，難以化精氣滋養骨髓，故腎虛是本病的主要病因。“骨痿”也與脾關系密切，若脾胃虛弱，氣血乏源，則肌肉失養，骨骼失去肌肉的支撐則骨弱難支。此外，肝血不足，精血失養，肝腎精虧或陰虛失養也可致骨質疏松的發生。原發性骨質疏松癥在臨床上一般分為腎陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證等6種證型[24]。臨床上以腎虛證為常見，治療以補腎為主，故研究者們也大多從OP腎虛證的分子機制中探索。

本課題組[25]前期檢測腎陰虛、腎陽虛證的絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者的lncRNA表達譜，篩選出腎陰虛、腎陽虛證組之間的差異表達lncRNA45條、差異表達mRNA35條，并構建了差異lncRNAs基因調控網絡，同時分析得出LINC00334等8條共同差異表達的lncRNAs。生物信息學分析表明它們可能通過調控JAK/STAT、MAPK等12條信號轉導通路來調節骨代謝平衡，從而參與腎陰虛證的發生發展過程[26]。在lncRNA芯片篩選的基礎上，課題組進一步驗證了lincRNAuc431+及其靶基因CLCF1在PMOP腎陰虛證中低表達[27]，且lincRNAuc431+可能對CLCF1負向調節。另外，課題組的研究[28]發現GAS5低表達可影響骨免疫相關細胞因子水平，從而通過對骨免疫通路的收縮影響骨代謝平衡，參與PMOP的發生和發展。這些研究表明了絕經后骨質疏松癥腎虛證患者中lncRNAs存在差異表達，它們參與了骨質疏松癥中醫證的發生發展。

4 OP中醫藥治療中lncRNA的調控

4.1 中醫藥干預OP模型對lncRNA表達的影響

現有研究[29-30]發現中草藥的生物活性成分靶向非編碼RNA，尤其是miRNA，lncRNA和circRNA，它們已成為許多疾病的新治療靶標。lncRNA相關中藥作用機制也已成為中醫藥研究的熱點領域，多種中藥可通過lncRNA發揮疾病治療作用[31]。臨床研究[32]表明中醫藥治療OP已具顯著療效，同時越來越多研究也逐步深入中藥調控lncRNA干預治療骨質疏松癥等骨骼疾病。柴爽[33]通過對去卵巢大鼠模型高通量測序后進行差異性分析，發現存在差異表達的17條lncRNA(9條上調和8條下調)和21條TUCP，對差異表達的lncRNA和TUCP進行靶基因預測發現其轉錄本預測到BMP家族，而進一步深入實驗證實了骨疏康可以通過刺激BMP-2/Smads信號途徑的活化來改善去卵巢大鼠模型的骨密度和骨微結構特性。張峰等[34]實驗發現淫羊藿苷干預治療能顯著提高兔骨質疏松臨床療效，優化股骨MEG3、H19和DANCR/ANCR三者lncRNAs表達水平。Zhang等[35]研究發現經過薯蕷皂苷元(diosgenin，DIO)干預，抑制了卵巢切除術(OVX)引起的大鼠牙槽骨量丟失，結果顯示在構建的共表達網絡中關鍵lncRNA與mRNA的相互作用，且部分lncRNA可能通過骨代謝途徑中的一些關鍵mRNA發揮作用，他們認為這種抗骨質疏松影響的機制可能在于DIO對lncRNA和mRNA表達譜的整體調節。

4.2 中醫藥調控lncRNA影響BMSCs成軟骨、成骨分化

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種有多向分化能力的細胞，經誘導下可向成骨細胞分化[36]，在骨質疏松癥的發生起著重要作用。梁晶亮[37]實驗發現左歸丸含藥血清在BMSCs成軟骨分化過程中影響相關lncRNA的表達，利用基因芯片技術在表達譜中共發現5個lncRNAs顯著上調，4個lncRNAs顯著下調；李亮[38]則研究發現右歸丸可能通過調控XR0072425等9個lncRNAs的表達來影響BMSCs的軟骨分化。

張順聰[39]實驗驗證了LncANRIL抑制細胞成骨分化因子的表達，并發現淫羊藿苷通過調控ANRIL-CDKN2B方式呈時間特異性的促進人BMSCs成骨分化。Fang等[40]發現活血通絡膠囊通過抑制內源lncRNA-Miat的轉錄表達，從而促進大鼠BMSCs的成骨。Hou等[41]研究揭示了數個mRNAs和lncRNAs在中藥活性成分(+)-cholesten-3-one誘導的成骨分化中起重要作用；當歸多糖(angelica polysaccharide，AP)是當歸的主要水溶性成分，Xie等[42]人發現AP以劑量依賴的方式上調了lncRNAH19的相對表達水平，反之抑制H19從而逆轉了AP對細胞增殖和成骨細胞分化的促進作用。同時，姚順晗等[43]發現羅漢果苷V通過促進LncRNATUG1表達刺激成骨細胞的增殖與分化。

中醫藥具有成分復雜、多靶點作用的特點，隨著lncRNA與骨質疏松癥分子機制關系的深入挖掘，中醫藥可通過調控lncRNAs發揮抗骨質疏松的作用機制更加清晰。但目前研究涉及臨床試驗尚少，仍需臨床進一步驗證補充。

5 展望

骨質疏松癥是一種全身代謝性疾病，其產生可能與干細胞的成骨分化減弱、成骨細胞的骨形成作用減弱、破骨細胞的增殖及骨吸收作用增強和免疫調控等多種作用機制有關；lncRNA作為一種參與骨代謝生物學過程的重要因子，從多種水平在骨質疏松癥發病機制中發揮重要作用。中醫藥治療原發性骨質疏松癥的原則是“辨證施治，病證結合，整體調節，防治結合”，治療OP的過程中具有不良反應小、不良反應發生率低的優勢[44]。但在長期使用過程中，仍需持續關注中醫藥使用的安全性問題，加強安全性指標監測，并且密切關注患者中醫證候的演變，及時調整處方或對癥處理。總之，OP中醫證具有復雜、難以客觀化及微觀化的特點，而lncRNA已在部分證型中呈現不同的差異性表達；與此同時，中醫藥也可調控lncRNA的表達水平影響OP“骨吸收-骨形成”的過程從而達到治療效果，由此推測lncRNA可能作為預測診斷及判斷預后的指標以及治療的潛在靶點，為深入探討中醫藥治療OP的機制研究提供新思路和新方法。