龜鹿二仙膠在骨質疏松癥領域研究進展及其現代應用迷思

司譽豪 馬勇 許奇 李紹爍 郭楊 潘婭嵐 王禮寧 劉孟敏 孫杰 涂鵬程 吳承杰楊光露 王建偉 尹恒*

1.浙江省中醫院骨傷科，浙江 杭州 310006 2.南京中醫藥大學骨傷研究所、骨傷修復與重建新技術實驗室，江蘇 南京 210023 3.南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院，江蘇 南京 210023 4.南京中醫藥大學無錫附院骨傷科，江蘇 無錫 214071

龜鹿二仙膠又名龜鹿二仙膏、龜鹿參芪膠、龜鹿膠等，出自于王三才所著《醫便》，由龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子組成，有滋陰養血、填精助陽等功效[1]。《醫便》載其：“專治男婦真元虛損，久不孕育……服此膠百日，即有孕……并治男子酒色過度，銷鑠真陰；婦人七情傷損血氣；諸虛百損，五勞七傷，并皆治之。”臨床常用于陰陽兩虛、虛勞、遺精陽痿、腰膝酸軟、痿軟無力、視物昏花等。中醫對于骨質疏松癥描述有“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”等，其中以“骨痿”癥狀最為貼切，《素問·痿論篇》曰“腎者水藏也……則骨枯而髓虛……發為骨痿。”張介賓也直言“腎痿者，骨痿也”。可見，腎虛髓虧為骨質疏松癥的根本中醫病機，這與龜鹿二仙膠適應癥相合，因此臨床常用于論治骨質疏松癥。目前尚無醫家對龜鹿二仙膠的現代臨床應用與機制研究進行系統總結，故而筆者整理了相關文獻進行綜述，為深入研究龜鹿二仙膠治療骨質疏松癥的臨床療效與機制提供相關參考。

1 臨床應用

當代醫家中，周修通[2-3]于2001年最早公開報道將龜鹿二仙湯運用于骨質疏松癥的治療中，他自擬“龜鹿二仙湯”聯合葡萄酸鈣片/碳酸鈣片用于治療罹患骨質疏松癥的老年女性，結果提示聯合使用“龜鹿二仙湯”可明顯增強西藥療效。而后楊偉岸[4]運用龜鹿二仙湯加味治療老年脊椎骨質疏松性腰背部疼痛獲得了92.1 %有效率，黃民興等[5]也觀察到龜鹿二仙膠可明顯降低脊椎骨質疏松性腰背痛老年患者VAS評分。陳治諶[6]的研究將龜鹿二仙膠丸劑與福善美進行對比，發現二者在骨代謝指標及骨密度(bone mineral density，BMD)方面均具有良好的療效，區別在于，福善美1年內即可顯著提高患者BMD，而龜鹿二仙膠丸劑的療效需3年方可較為明顯。尹恒等[7]亦是將龜鹿二仙膠與西藥單獨對比，發現龜鹿二仙膠對于原發性骨質疏松癥患者BMD的提升效果顯著優于阿爾法骨化醇。王科艇等[8]的研究稍有不同，他們將龜鹿二仙膠與福美加聯用鈣爾奇作對比，發現兩種療法干預6月后在BMD方面無顯著差異，而龜鹿二仙膠可額外加強患者日常體力、精力，在提升患者健康狀況上略優于聯用福美加與鈣爾奇。

注射用鮭魚降鈣素可以顯著降低高轉換型骨丟失[9]，齊潤文[10]發現龜鹿二仙膠聯合鮭魚降鈣素可明顯緩解骨質疏松性腰背痛，且長短期療效均明顯強于單用鮭魚降鈣素。此外，也有將龜鹿二仙膠與抗阻運動聯合使用的報道，結果顯示抗阻運動與龜鹿二仙膠均可改善患者高轉換型骨代謝，提高腰椎、髖部BMD，而二者聯用后對患者破骨細胞相關指標的抑制作用明顯優于單用其一[11]。齊鵬坤等[12-13]針對絕經后骨質疏松癥進行了兩種試驗方案，既采用龜鹿二仙膠對比阿侖膦酸鈉，也比較了兩藥聯用與單獨阿侖膦酸鈉/龜鹿二仙膠的療效差異，結果顯示二者聯用比單用其一可顯著提高患者BMD，緩解疼痛。并且，龜鹿二仙膠抗骨質疏松作用可能與調節患者體內雌二醇、睪酮有關。張健[14]的研究方案與齊鵬坤等[13]幾乎相同，結果顯示，龜鹿二仙膠聯合阿侖膦酸鈉對于絕經后骨質疏松癥的臨床療效優于阿侖膦酸鈉，可明顯升高患者腰椎及股骨近端BMD，改善血清IGF-1及TNF-α水平。

2 基礎研究

2.1 在體實驗

對于龜鹿二仙膠治療骨質疏松癥的具體機制研究目前仍僅見于國內學者及文獻，目前涉及到的動物模型包括：去卵巢(OVX)大鼠骨質疏松模型[15-21]、激素誘導大鼠骨質疏松模型[22-23]、激素誘導斑馬魚骨質疏松模型[24-26]。其中，以卵巢切除12周后建立的OVX大鼠骨質疏松模型最為常見，張瑤等[17,19-20]以OVX大鼠為對象進行了三種實驗方案，首先他們對比了龜鹿二仙膠與戊酸雌二醇片，結果顯示，與戊酸雌二醇片比較，龜鹿二仙膠治療組 Ca 含量、BMD顯著增高，而P、Ca/P、β-Crosslaps、PINP 含量差異均無統計學意義。而后他們比較了包括龜鹿二仙膠在內的多個補腎方對于OVX大鼠骨質疏松模型生物力學以及骨代謝指標的影響，發現龜鹿二仙膠、補腎健脾方、仙靈骨葆膠囊組的大鼠BMD顯著高于雌二醇組大鼠，而二仙湯組與仙靈骨葆膠囊組的β-Crosslaps顯著降低。在二仙湯、龜鹿二仙膠、補腎健脾湯三者比較中，補腎健脾湯組β-Crosslaps及PINP含量均顯著增高，龜鹿二仙膠組PINP含量顯著增高，Ca/P比值高于仙靈骨葆膠囊組、二仙湯組、補腎健脾湯。在腰椎壓縮試驗及股骨三點彎曲試驗中，龜鹿二仙膠組、二仙湯組、補腎健脾湯組的最大負荷量、最大應力、彈性模量明顯高于雌二醇組與仙靈骨葆膠囊組，其中以龜鹿二仙膠組最為顯著，表明其具有提升OVX大鼠生物力學性能，改善鈣磷代謝，促進骨形成與抑制骨吸收的功效。上述三種方案[17,19-20]均使用了同一種干預劑量，而牛素生等[16,18]研究則將龜鹿二仙膠分為高、中、低劑量進行干預，通過測定OVX大鼠血清E2、血清ALP、TRACP、左側股骨BMD、最大載荷、骨小梁面積等指標發現，中劑量(按體表面積換算人臨床用量而來)龜鹿二仙膠對于調節OVX大鼠激素水平，增強骨密度與骨顯微結構效果最佳。陳竑明等[21]的研究方案與張瑤等[17,19-20]類似，但著重檢測了骨骼肌Akt蛋白表達量，發現龜鹿二仙膠對OVX大鼠有顯著的治療作用，能升高腰椎BMD及Akt蛋白和基因的表達量。王立新[15]將龜鹿二仙膠與倍力美對比，發現龜鹿二仙膠提取物對大鼠脛骨上段松質骨的靜態學參數及動態學參數都有較好的改善作用，在股骨中段的皮質骨、遠段松質骨、腰椎松質骨的生物力學改善效果與倍美力相近。

郭建博[22]與徐衛峰[23]均采用地塞米松誘導大鼠骨質疏松模型，前者檢測血清指標與牛素生等[16]的研究相近，包括TRACP-5b、ALP、N-MID-OT、股骨BMD等，結果表明龜鹿二仙膠對于激素誘導的骨質疏松大鼠也具有提高骨密度、促成骨、抑破骨的作用，且效果明顯優于阿侖膦酸鈉。后者著重探討機制，將龜鹿二仙膠分為高、低劑量組，發現兩種劑量均能顯著增加大鼠股骨BMD，降低血清ALP、IL-6、IL-β、TNF-α水平，提高降鈣素與血清E2。Western blot顯示大鼠滑膜Nrf-2、HO-1蛋白表達顯著升高，而p-IκB、P-NF-κB蛋白表達明顯下降，表明龜鹿二仙膠發揮抗骨質疏松作用可能與調控Nrf-2/HO-1/NF-κB有關聯。

尹恒[25]與錢哲[26]的研究均采用了激素誘導的斑馬魚骨質疏松模型。前者證實了龜鹿二仙膠能夠促進激素誘導的斑馬魚骨質疏松模型合成I型膠原蛋白，且此機制是通過上調TGF-β/Smad信號通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2及下游蛋白Smad3實現的。后者除再次驗證龜鹿二仙膠抗骨質疏松作用與激活TGF-β/Smad信號通路有關外，還發現龜鹿二仙膠可降低IL-6、IL-β、TNF-α等炎癥因子，調控核轉錄因子NF-κB和AP-1抑制炎癥反應所致骨量丟失。

2.2 離體實驗

目前龜鹿二仙膠的離體實驗均為細胞水平研究，涉及成骨細胞(osteoblasts，OB)/成骨細胞系(Mc3t3-E1、ROS17/2.8)、破骨細胞(osteoclasts，OC)、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，人子宮內膜基質細胞(human endometrial stromal cells，HESCs)。徐衛峰[23]采用地塞米松誘導小鼠成骨細胞系Mc3t3-E1損傷，觀察龜鹿二仙膠含藥血清對成骨細胞系的保護作用，發現含藥血清組的細胞上 IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著下降。Western blot結果發現Nrf-2、HO-1蛋白表達明顯升高，并且p-IκB、P-NF-κB蛋白表達明顯下降。表明龜鹿二仙膠可顯著改善地塞米松誘導的骨質疏松，且機制與調控Nrf-2/HO-1/NF-κB有關，該結果與其在體實驗結果相吻合。而錢哲等[27]采用了大鼠成骨肉瘤細胞系ROS17/2.8，發現龜鹿二仙膠可通過調控TGF-β而促進 I 型膠原的表達起抗骨質疏松作用。該結果與尹恒[25]一致，后者發現龜鹿二仙膠含藥血清可明顯提高ROS17/2.8細胞株TGF-β1、TGF-β2、Smad3、COL1A1、COL1A2蛋白及基因表達量。袁明陽[28]同樣采用了ROS17/2.8作為研究對象，其實驗方案、結果與尹恒[25]、錢哲等[27]的研究基本一致，在此不做過多贅述。錢康[29-30]的兩項研究均體外分離大鼠原代OB，分別探究了不同濃度龜鹿二仙膠含藥血清(20 %、15 %、10 %)對OB增殖、周期以及OPG/ODF系統的影響，結果顯示龜鹿二仙膠含藥血清對OB具有促進增殖和抗凋亡作用，且濃度越高，效果越顯著。同時當含藥血清濃度在20 %時OPG基因表達量最高，而ODF基因表達量最低，亦是呈現出了濃度依賴性。該結果與朱崇梅[31]的結果如出一轍，后者亦是發現龜鹿二仙湯含藥血清可呈劑量依賴性地促進OB增殖分化，并且上調OPG表達和抑制ODF表達。

毛翠平等[32]不但體外分離得到大鼠原代OB，還利用1,25(OH)2D3誘導骨髓單核細胞獲得原代OC，發現10 %龜鹿二仙膠含藥血清可增加 IGF-1分泌量，促進OB增殖，并且能夠顯著抑制由1,25(OH)2D3誘導的破骨分化，起抗骨質疏松作用。楊樹華等[33-34]應用龜鹿二仙膠醇提物干預RAW264.7誘導的破骨樣細胞，發現與生理鹽水組比較，龜鹿二仙膠醇提物含藥血清可降低破骨樣細胞 CtsK、TRAP基因表達，提高CTR基因表達，抑制骨吸收活性。牛素生等[35]觀察了龜鹿二仙膠含藥血清對BMMSCs成骨分化的作用，發現10 %龜鹿二仙膠含藥血清與成骨誘導液都可以促進BMMSCs向OB分化，且作用機制可能與增強Fzd-2表達、抑制Axin-2表達和激活Wnt/β-catenin通路有關。不僅如此，徐衛峰等[36]還發現龜鹿二仙膠含藥血清能夠保護BMMSCs細胞活性，免受地塞米松損傷，降低炎性反應。尚冰等[37]的研究較為與眾不同，他們并未采用常用的含藥血清作為干預手段，而是觀察了不同濃度龜鹿二仙膏(10-4、10-6、10-8mol /L)對HESCs增殖和胰島素樣生長因子(IGF)-1表達的影響。結果顯示，高濃度龜鹿二仙膏能夠顯著促進HESCs增殖活性，提升 IGF-1基因、蛋白表達。一定程度上說明了龜鹿二仙膠具有調節卵巢相關激素水平的功效，通過延緩女性衰老從而改善圍絕經期女性骨質疏松。

3 現代應用迷思

3.1 相關研究量明顯不足

筆者通過檢索PubMed、中國知網(CNKI)、萬方數據庫(Wanfang Database)搜集文獻，然而并未檢索到任何相關英文文獻。此外，作為著名填精益髓、延年益壽的名方，龜鹿二仙膠相關的中文文獻數量也明顯不及其他補腎經方。以CNKI舊版為例，檢索日期為從建庫至2020年11月11日，以“篇關摘”檢索“龜鹿二仙”可得結果共計286條，同樣方法檢索“左歸丸”(1 346條)、右歸丸(1 322條)、六味地黃丸(5 325條)、地黃飲子(1 102條)、金匱腎氣丸(2 232條)。個中原因頗多，但筆者推測，如此大的差異最有可能與龜鹿二仙膠藥材價格相關。龜甲膠、鹿角膠、人參均為名貴藥材，根據阿里巴巴自營健康醫藥旗艦店報價，龜甲膠(四方箄)售價為720元/盒(200 g)，鹿角膠(北京同仁堂)售價為1 026元/盒(108 g)，而金匱腎氣丸(北京同仁堂)15元/盒(60 g)、六味地黃丸(仲景牌)35元/盒(360丸)，左歸丸(仲景牌)65元/盒(45 g)。原材料價格昂貴、需長期服用等因素無疑抬高了龜鹿二仙膠的研究門檻，將研究經費不甚充裕的科研團隊拒之門外。

3.2 臨床應用方法不一

當前貫以“龜鹿二仙膠”名稱的研究一定程度上存在名不符實的現象，不少研究者所用處方的組成、劑量、劑型等與龜鹿二仙膠原方相差較大，難以體現龜鹿二仙膠對于骨質疏松癥的治療作用。例如有早期研究的處方為龜板12 g、鹿角片12 g、仙靈脾12 g、威靈仙12 g、熟地12 g、肉蓯蓉12 g、巴戟天12 g、黃芪12 g、黨參12 g、當歸12 g、紅花3 g[2-3]。該方以“龜鹿”為君，另加藥9味，且無人參與枸杞子，龜板與鹿角片皆未制成膠狀，顯然與龜鹿二仙膠原方相去甚遠。此方雖以“龜鹿二仙”為名，但并不足以代表龜鹿二仙膠。又如陳治堪[6]采用了以淀粉與蜂蜜制成的龜鹿二仙膠(丸劑)，且原藥材仍然是使用了未制膠的龜板與鹿角。無獨有偶，齊鵬坤等[12-13]所用處方為龜板10 g、鹿角10 g、人參10 g、枸杞15 g，名為龜鹿二仙湯。龜板性寒，味甘咸，可滋腎潛陽，退虛熱。而龜甲膠是由龜甲反復煎熬、濃縮制成的膠狀物，性平，具有滋陰潛陽、養血補血功效。同理，鹿角制成鹿角膠后藥性與功效也不可避免的發生改變，因此，所有未將“龜鹿”制成膠狀物的研究能否算作是龜鹿二仙膠的現代應用研究仍有待商榷。

此外，當代醫家所用龜鹿二仙膠各藥的配比也是不盡相同。據第五版高等醫藥院校教材《方劑學》記錄的《醫方考》原藥材配比為，鹿角(5 kg)∶龜板(2.5 kg)∶枸杞子(1.5 kg)∶人參(0.5 kg)=10∶5∶3∶1[38]，但并未言明龜板膠、鹿角膠與人參、枸杞子的具體比例。我們注意到當前四藥臨床配比大致為鹿角膠10～18 g、龜板膠10～18 g、人參10～20 g、枸杞子15～30 g[4-5,8,10-11]，所有文獻均未注明如此使用的出處和根據。還有學者直接購買中成藥“龜鹿二仙膏”進行臨床試驗，其配置比例更是難以考證[6-7,14]。總之，雖配比上仍有無法考據的內容，但可以肯定，直接采用龜板、鹿角制成的貫以“龜鹿二仙”名稱的復方并不能較好的代表龜鹿二仙膠的臨床療效，未來研究的處方仍應遵從經典原方組成、藥物劑型及藥材配比。

3.3 細胞水平干預方式爭議

此次檢索到的所有體外實驗文獻絕大部分均采用了同種屬動物含藥血清的方式進行細胞實驗。唯有尚冰等[37]采用了直接體外中藥給藥的方式，龜鹿二仙膠雖僅有四味中藥，組方精簡，但兼具植物藥與動物藥，化學成分十分復雜。現有相關研究數量稀少，尚無法確定龜鹿二仙膠是通過藥物成分直接起效，還是經過肝臟代謝后產物發揮作用，亦或是憑借第二信使起到間接作用[39-40]。因此，也無法斷言尚冰等[37]的實驗方案就不如其余基于血清藥理學的研究。單從目前中醫藥領域研究方法而言，使用血清藥理學的研究認可度更高，更貼近復雜藥物在內環境中的藥物起效過程。然而在龜鹿二仙膠含藥血清的使用上各學者間也存在些許不同。一部分學者以低、中、高三種劑量灌胃大鼠，隨即將所得的相應含藥血清定義為低、中、高三種[23,25-28,32,36]。而其余學者均是由同一濃度中藥灌胃后提取含藥血清，在干預細胞時再調整相應濃度(例如10 %、15 %、20 %等)[29-31,35]。兩種方法均有各自的理論支撐點，前者模擬不同濃度藥物在體內代謝，更接近現實代謝情況，而后者摒除了不同濃度藥物在體內代謝的異質性，縮小了個體差異，具備更強的均一性和可重復性。由此可見，目前無論是從藥物直接發揮作用，還是借助含藥血清進行實驗都存在難以避免的爭議，將來研究除了繼續探索這兩種方式以外，還可關注第二信使在龜鹿二仙膠與細胞間通訊所起的作用，例如時下較熱門的外泌體、微小囊泡等。

4 小結與展望

目前龜鹿二仙膠相關研究仍顯匱乏，且現有研究存在臨床應用方法迥異，細胞水平干預方式爭議等問題，總體上缺乏準度與深度。故而將來研究可從如下幾方面入手：①開展多中心、大樣本、高質量的臨床試驗進一步驗證療效；②進行藥物質控研究，規范和制定相對精準化的配方和劑量；③探索細胞水平給藥方式，如細胞外囊泡等第二信使在骨細胞間通訊的作用；④優化藥物制備方式，降低成本和研究門檻。龜鹿二仙膠是陰陽雙補，延年益壽的名方，研究其抗骨質疏松作用對拓寬和明確中醫復方應用范圍大有裨益。此文旨在厘清現狀，拋出重點問題，以待今后同道勠力同心，為此方正名。