骨髓間充質干細胞對骨質疏松的治療作用

冼群澤 季興華 霍建忠 葛軍勇 郭耀

1.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030000 2.山西白求恩醫(yī)院，山西 太原 030000

1 骨質疏松的發(fā)病機制與治療現(xiàn)狀

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種由多因素引起的以單位體積骨量減少，骨組織微結構破壞為特征，從而導致骨脆性增加，骨折風險增高的全身性骨代謝疾病[1]。人體的骨骼時刻在經歷動態(tài)的變化過程，舊的骨質不斷被破骨細胞所產生的單核巨噬細胞吸收降解，而新骨則由來源于骨髓間充質干細胞的成骨細胞重塑。雖然各類骨質疏松的發(fā)病機制有所不同，但最終都表現(xiàn)為破骨細胞和成骨細胞活動失衡導致的骨重建平衡的破壞，從而使骨吸收速度超過骨形成速度[2]。因此，促進新骨形成以補充丟失的骨組織是治療此類疾病的關鍵。目前，臨床上對于OP患者多采用藥物治療、物理治療和運動療法[3-5]。盡管對骨質疏松的治療取得了很大進步，但其治療效果仍難達到臨床預期，一方面很多新研發(fā)抗骨質疏松藥物價格昂貴，普通人難以承受，限制了其在臨床上的廣泛應用；另一方面患者依從性差，不良反應較多[6-7]。近年來，越來越多的學者開始關注骨髓間充質干細胞與骨質疏松的相關性研究，骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞并進一步形成骨細胞，是機體內骨組織更新的唯一途徑，研究表明，MSCs數(shù)量的減少或成骨功能的缺失，會直接引起OP[8-9]。因此，通過系統(tǒng)或局部移植正常功能的BMSCs并促進向成骨方向分化，是其治療OP的關鍵。

2 骨髓間充質干細胞概述

Friedenstein等[10]首次在骨髓中發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞，這種細胞貼壁生長，呈梭形，能形成單細胞來源的集落。BMSCs廣泛存在于中軸骨及外周骨松質骨骨髓腔中，能夠自我更新并分化成多種細胞類型，是當前組織工程研究理想的種子細胞。無論從動物模型還是人體試驗，BMSCs的應用都涉及很多疾病，包括骨關節(jié)炎、血管修復、骨折愈合、骨質疏松癥等[11-13]。骨質疏松患者MSCs的增殖、成骨分化能力均下降，但通過移植骨髓間充質干細胞則為治療骨質疏松開辟了新領域。研究表明移植骨髓間充質干細胞促進骨再生，改善骨質量主要通過兩種機制起作用：(1)骨髓間充質干細胞向受損部位或病理區(qū)域歸巢，然后分化成骨細胞，合成新的骨組織，修復退化組織；(2)骨髓間充質干細胞通過分泌某些生長因子，改變周圍微環(huán)境，并招募其他相關細胞，以旁分泌的方式作用修復退化組織[14-15]。體外培養(yǎng)的間充質干細胞最多可達到15～30個群體倍增[16]。而大規(guī)模的體外擴增會導致BMSCs增殖和分化能力的喪失，Mandana等[17]通過體外培養(yǎng)不同年齡段的人體骨髓間充質干細胞發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的增殖能力逐漸減弱，分化潛能從第6代開始下降，端粒酶的長度也逐漸出現(xiàn)磨損，推測端?？s短與細胞的衰老有關。Samantha等[18]發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖能力在第7代開始出現(xiàn)下降，不同的是隨著時間的推移，端粒的長度及線粒體活性保持穩(wěn)定，低代與高代細胞之間并無顯著差異。因此，對于端粒酶的縮短是否與BMSCs細胞的衰老有關，目前還存在爭議。從活體內提取間充質干細胞的數(shù)量總是有限的，必須通過體外擴增，以達到足夠治療數(shù)量的BMSCs。盡管BMSCs能夠自我更新，有很強的增殖能力，但是有限的增殖壽命也一定程度上限制了骨髓間充質干細胞的進一步應用。

3 BMSCs移植治療OP的可行性

骨髓間充質干細胞的增殖能力及移植的存活率和植入率是影響骨髓間充質干細胞治療效果的主要因素。因此，提高移植細胞的存活率、開發(fā)高質量可靠的體外MSC培養(yǎng)物、選擇合適的移植方法、促進細胞歸巢等是促進BMSCs治療骨質疏松效果的關鍵。

3.1 提高移植細胞的抵抗性與存活率

BMSCs移植到體內卻要面臨著缺血缺氧，缺乏營養(yǎng)物質的病理環(huán)境，移植后氧化應激作用可在局部區(qū)域介導間充質干細胞大量凋亡，降低其存活率，影響治療效果。Robert等[19]于1983年首先提出“適應性細胞保護”的概念，即細胞在低于生理閾值的應激刺激條件下，可通過調節(jié)自身穩(wěn)態(tài)提高對抗應激刺激的耐受性。有學者嘗試通過對體外培養(yǎng)的細胞低氧預處理，提高移植細胞的耐受性。Meng等[20]將體外培養(yǎng)的BMSCs分為正常培養(yǎng)組(20%O2)和缺氧培養(yǎng)組(1%O2)，檢測細胞的凋亡和遷移，結果顯示低氧預處理組骨髓間充質干細胞的遷移和存活率明顯高于正常培養(yǎng)組。一定程度的缺氧處理能提高BMSCs的存活率、增殖能力、促進BMSCs的多能性，而研究重點在于優(yōu)化最合適的氧濃度以提高BMSCs的細胞活性和治療效果[21]。另外，Zhou等[22]將維生素C化學修飾到三維石墨烯泡沫材料上，研究其對人骨髓間充質干細胞成骨的調節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)維生素C對氧化應激所致的成骨抑制有明顯的保護作用，能顯著提高BMSCs的成骨能力。無論是正常BMSCs還是經過氧糖剝奪誘導的間充質干細胞，在經過脂多糖預處理后均可提高BMSCs的存活率及遷移能力，這可能與脂多糖預處理促進血管內皮生長因子(VEGF)表達及激活Toll樣受體，增強細胞對缺血缺氧適應性有關[23-24]。三維或3 D培養(yǎng)模型模擬靶組織內復雜的環(huán)境，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)技術增強了細胞間的相互作用，促進抗凋亡基因的表達，有助于提高移植細胞的存活率[25-26]。

3.2 基因修飾或細胞表面修飾

通過對BMSCs進行基因修飾或細胞表面修飾等手段，可以促進細胞的歸巢，提高存活率。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)屬于轉化生長因子，能夠刺激誘導BMSCs成骨分化，促進成骨細胞成熟，提高細胞成骨活性。Ruan等[27]發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導轉染的BMP-2在體外能提高BMSCs活力，誘導成骨相關基因的表達，促進成骨分化。肝細胞生長因子(HGF)能夠提高成骨相關基因的表達，促進成骨分化，提高細胞歸巢效率[28-29]。此外，通過對BMSCs表面進行修飾、靶向改造也能提高細胞的歸巢效率。這種方法主要利用酶修飾、化學偶聯(lián)或非共價相互作用、生物特異性識別(抗原抗體或配體受體)等。例如，CXCR4是趨化因子基質細胞衍生因子的特異性受體，通過促進細胞膜表面高表達CXCR4，能明顯促進MSC的歸巢，提高移植細胞治療效果[30]；P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)重組的MSCs能夠促進抗炎細胞因子白細胞介素-10(IL-10)的靶向傳遞，提高BMSCs的歸巢效果[31-32]。相比于基因修飾，細胞表面修飾避免了細胞長期安全性和毒性問題，其主要通過增強MSC的粘附和植入，而不影響其存活能力、多能性、增殖和分化潛能[33-34]。

3.3 選擇合適植入途徑或聯(lián)合使用生物支架

BMSCs治療骨質疏松主要通過干細胞移植方式，植入途徑主要可分為3種：局部植入(靶組織植入)、全身植入、聯(lián)合生物相容性支架植入。全身植入主要方式是血管內給藥包括動脈給藥及靜脈給藥[35]。越來越多的證據(jù)表明，BMSCs的治療效果不僅和移植細胞的有效數(shù)量有關，和植入途徑也有很大關系，為了達到最佳的治療效果，有必要選擇合適的植入方式。血管內給藥相比于局部植入，被認為是一種微創(chuàng)途徑，能夠有效避免靶組織的創(chuàng)傷，但干細胞移植入體內后會受到歸巢效應的影響，治療效果不確切，首先是靜脈給藥，細胞通過靜脈輸注，隨著血液的流動，由于肺是第一個通過的器官，高比例的細胞可能滯留在肺部，其他器官包括肝、脾等也有可能因細胞滯留產生嚴重的影響循環(huán)的微栓子[36-37]。動脈給藥通常被認為可以避免細胞滯留在肺部，并且動脈血流動更強勁有力，可以提高細胞歸巢比例，然而還是無法避免可能形成微栓子，造成諸如腦栓塞等血管閉塞的風險，這是一個必須考慮的重要安全問題[38-39]。局部植入是針對病變部位，直接將干細胞移植到相應部位，局部療效滿意，但操作較為復雜，不可避免對靶組織造成人為損害。此外，還有肌肉注射、皮下注射及腹腔注射的給藥方式，肌肉注射被認為是一種安全簡單的移植方式，并且可以提高細胞滯留時間，其發(fā)揮治療效果的機制與BMSCs的旁分泌作用有關[40-41]。此外，聯(lián)合應用各種生物相容性支架，能進一步促進細胞歸巢。這種支架由最初的羥基磷灰石和磷酸三鈣為材料發(fā)展到包括膠原材料、殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素等多種新型材料組成，具有更高的生物相容性，這種移植方式能顯著提高移植細胞存活率[42-43]。

3.4 聯(lián)合藥物或物理刺激

聯(lián)合使用一些藥物或者物理刺激手段，能起到增強BMSCs治療效果的作用。甲狀旁腺激素類似物PTH(1-34)是唯一一種促進成骨的臨床藥物，研究發(fā)現(xiàn)PTH通過多種細胞因子及(SDF-1)/(CXCR4)軸調控骨骼代謝，影響B(tài)MSCs的動員，間歇性小劑量使用PTH(1-34)，起到促進BMSCs的增殖和成骨分化的作用[44-45]。張媛等[46]發(fā)現(xiàn)，臨床常用的藥物骨肽原液，通過上調ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關基因，促進Runx2、OCN等成骨相關蛋白的表達，發(fā)揮促進BMSCs成骨活性的作用。一些中藥提取物、中藥含藥血清也起到促進BMSCs向成骨細胞分化的效果[47-49]。另外，一些物理刺激手段同樣能協(xié)同BMSCs的治療。Zhang等[50]通過采用不同劑量徑向沖擊波處理體外培養(yǎng)的MSCs，并移植到兔體內觀察其對軟骨缺損的修復作用，結果表明，沖擊波能顯著促進MSCs的增殖和自我更新，加速軟骨修復過程，顯示出良好的臨床效果。對靶組織行脈沖式聚焦超聲(pFUS)聯(lián)合靜脈注射MSC，能明顯促進細胞歸巢，這可能由于脈沖聚焦超聲作用于靶組織引發(fā)上調了調節(jié)細胞歸巢的局部化學因子，改變了血管通透性，促進MSCs向靶組織遷移[51-52]。

3.5 非細胞治療

研究表明骨髓間充質干細胞主要通過旁分泌途徑，特別是通過分泌營養(yǎng)因子和細胞外小泡(EVs)的方式發(fā)揮治療作用，這種胞外小泡在骨代謝中扮演重要角色。Xie等[53]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs來源的外泌體能夠促進成骨細胞的增殖，下調成骨細胞凋亡相關基因抑制細胞凋亡，改善骨質疏松。Zhao等[54]發(fā)現(xiàn)，MSCs來源外泌體主要通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，上調該通路相關蛋白的表達，促進成骨細胞增殖，發(fā)揮抗骨質疏松的作用。干細胞來源性胞外小泡作為治療手段避免了體外培養(yǎng)細胞面臨衰老、凋亡，植入細胞引起免疫反應，細胞存活率、歸巢率低等缺點，是一種潛在替代細胞治療的有效、安全、創(chuàng)新性的治療方法。

4 問題與展望

隨著再生醫(yī)學的發(fā)展以及干細胞研究的深入，骨髓間充質干細胞作為一種新的治療骨質疏松癥的策略越來越受到研究者重視。移植BMSCs治療骨質疏松癥雖被證實療效肯定，前景廣闊，但仍有不少挑戰(zhàn)，包括對細胞進行修飾具有潛在的突變和致癌風險、移植相關的免疫排斥風險、人類病原體的傳播風險等；來源于BMSCs的分泌小泡如何作用于靶組織發(fā)揮治療作用，如何傳遞細胞因子及對細胞的激活、控制凋亡的途徑，相關的作用機制尚有待進一步研究。值得肯定的是BMSCs應用于治療多種疾病模型，特別是骨疾病方面，已顯示出其巨大潛力。相信隨著研究的深入以及材料科學的進步，應用骨髓間充質干細胞治療骨質疏松將不再是挑戰(zhàn)。