補腎法促干細胞歸巢在骨質疏松中的應用

余富勇 余翔 鄉曉嵐 沈耿楊 尚奇

陳文敏1 湯凱1，2 陳桂鋒1，2 王曉文1 江曉兵2* 任輝2*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510400 2.廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨病[1]。老齡化是OP的危險因素，我國已經步入老齡化社會，且老齡人口依舊呈現增長趨勢，OP發病率隨之增長[2]。OP的治療消耗了家庭和社會的較大精力和財富。目前，防治OP的藥物并不能滿足當前的需求。干細胞療法是目前治療OP的一種新興療法，國內外已有研究報道了干細胞移植可有效防治OP[3-4]。干細胞移植后，可歸巢到OP局部損傷區域，但目前干細胞移植后存在歸巢效率不佳的問題，從而限制了干細胞的治療效果，成為干細胞治療OP的瓶頸之一。

因此，為提升干細胞移植治療OP的療效，提升干細胞歸巢效率具有不可忽視的重要意義。近年來的研究發現，補腎法能夠有效促進骨再生[5]，補腎中藥和方劑在促進干細胞歸巢方面發揮著重要作用。因此，探究補腎法促干細胞歸巢在骨質疏松中的應用具有重要意義。本文擬探討補腎法促干細胞歸巢在骨質疏松中的應用前景。

1 補腎法治療OP的中醫內涵

OP屬于中醫古籍所載的“骨痿”“骨枯”[6]?！端貑枴酚涊d：“腎者……精之處也……其充在骨”，《醫經精義》云：“腎藏精，精生髓，髓養骨”，OP多由腎虛所致，腎精漸衰導致骨髓無力生化，骨量稀少，引發OP。因此OP的治療關鍵是補腎。中醫多從補腎陰、補腎陽治療OP?！端貑枴分刑岢觥瓣幵趦龋栔匾?；陽在外，陰之使也”。陽化氣不足，骨髓無力生化，進一步使陰成形受損，致使骨質形成功能降低，是“陰陽失衡”引發OP的重要過程。補腎法通過補充腎精激發“陽化氣”功能，進而改善“陰成形”能力促進骨再生，恢復丟失的骨量，治療OP。本文重點論述補腎法激發“陽化氣”功能階段的機制。

2 干細胞的歸巢機制

歸巢是一個協調的多步驟過程，包括滾動、內皮細胞粘附及最終由選擇素和整合素介導的跨內皮細胞遷移[7]。間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)最常用于OP的治療，其壁龕位于血管壁附近，骨小梁的內表面，在纖維間隙內，少量存在于臍血、牙組織、滑液和肌肉中，因此可能從血流、骨髓、肌肉或骨膜中遷移[8]。目前，干細胞歸巢的機制并不明確。在歸巢的啟動研究方面，主要圍繞基質細胞衍生因子(stromal cell derived factors，SDF-1)與CXCR4軸展開，遷移的過程與整合素及鈣粘蛋白密切相關，遷移后的細胞行為也會對歸巢產生影響。

2.1 干細胞歸巢與SDF-1/CXCR4軸

干細胞的遷移通常由組織釋放的信號分子啟動，其中SDF-1/CXCR4備受關注。SDF-1與CXCR4的表達在一定程度上提示了干細胞的歸巢能力，且與年齡及OP密切相關，年輕大鼠中的MSCs向SDF-1遷移的能力及CXCR-4的表達水平高于成年大鼠，顯著高于OVX大鼠[9-10]。Chen等[11]用熒光標記法在小鼠體內輸注Aln-Lipo-SDF-1，生物光子成像顯示其在骨組織中積聚，且移植的GFP+MSCs被骨髓吸引，SDF-1表達上調觸發了MSCs遷移，促進骨再生。這表明通過對SDF-1的修飾，可促進歸巢，提高骨量，進一步證實了SDF-1與MSCs遷移的緊密聯系。

SDF-1的趨化作用也受趨化細胞CXCR4表達水平的影響，表達水平越高，歸巢能力越高，且SDF-1對不表達CXCR4的細胞不具有趨化歸巢的作用[12]。Sanghani等[13]用CXCR4轉染MSCs并注射到OVX大鼠中發現，CXCR4轉染能夠顯著提高OVX-MSCs的CXCR4的表達(從19%到40%)，僅能較少提高年輕大鼠MSCs的CXCR4表達(5%)，未轉染的年輕MSCs能夠高表達內源性CXCR4(92%)。年輕MSCs能夠具有高表達CXCR4的能力，因而，Sui等[14]認為，移植年輕或健康MSCs治療OP時，無需用CXCR4進行轉染。

2.2 干細胞歸巢與細胞間接觸

通過SDF-1/CXCR4軸啟動MSCs歸巢后，為了使細胞遷移，必須破壞細胞與細胞之間、細胞與基質之間的接觸，為此，需通過局部釋放酶來破壞鈣粘蛋白和整合素的接觸。整合素α4β1結合纖維粘連蛋白和血管細胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)可促進干細胞的遷移，且用其擬肽制配體與對骨有高度親和力的藥物結合可改善骨髓間充質干細胞的歸巢，增加骨膜部位的骨形成[1]。破壞細胞原有接觸的過程也與AKT的活化有關，AKT可能通過增加肌動蛋白和肌球蛋白的分泌促進骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)的遷移，也可能與降解細胞外基質及基底膜有關。Liu等[9]用ADM3100(SDF-1阻斷劑)預處理細胞對SDF-1表達進行觀察后發現，細胞磷酸化AKT(p-AKT)的水平降低。這些結果表明干細胞在相應的條件下可以破壞細胞間、細胞與基質間原有的接觸，促使遷移的發生。

2.3 干細胞歸巢與成骨分化

干細胞遷移后發生成骨分化時，成骨相關因素也對MSCs的遷移產生影響。汪偉等[15]的研究表明，Runx2基因過表達可能激活了CXCL12(即SDF-1)/CXCR4信號軸，從而促進了MSCs的體外遷移。但是當MSCs分化為成骨細胞后，SDF-1/CXCR4信號軸對已分化為成骨細胞的MSCs將不再具有趨向性。Sanghani-Kerai等[10]的研究也表明，轉染CXCR4的MSCs分化為成骨細胞后，盡管其能夠表達CXCR4，但并不向SDF-1遷移，這可能與分化后細胞外基質的沉積及基質金屬蛋白酶使SDF-1失活有關?？梢?，SDF-1/CXCR4是啟動干細胞歸巢的關鍵軸之一。歸巢啟動后，整合素與鈣粘蛋白的結合降低破壞了細胞與細胞、細胞與基質的接觸，促進了干細胞的歸巢。然而，遷移后的干細胞成骨分化后，其遷移能力將會降低。這種現象可能與細胞外基質的沉積及基質金屬蛋白酶的分泌使SDF-1失活有關。相關激素的運用也能夠促進干細胞的遷移，但該方面的研究較少，其機制尚不明確。

3 補腎法促干細胞歸巢

先天之精具有干細胞的屬性。干細胞是腎精在分子水平的表現形式[16]。先天之精不足導致干細胞的“陽化氣”功能受損，使干細胞歸巢能力減弱，進而影響“陰成形”功能。補腎法可補充腎精并激發機體“陽化氣”功能促進干細胞歸巢，進而促進干細胞“陰成形”的成骨功能，恢復丟失骨量，從而治療OP。當人體處于疾病狀態，干細胞的“陽化氣”功能降低，自身的干細胞無法滿足促進損傷組織修復的需求，需要進行外源性干細胞注射，但其歸巢效率低[17]，需要通過補腎法激發干細胞“陽化氣”功能改善歸巢效率。補腎法可通過激發內外源性干細胞的“陽化氣”功能促進干細胞的歸巢。

3.1 補腎法促內源性干細胞歸巢

3.1.1補腎中藥促內源性干細胞歸巢：大量研究證實補腎中藥在促進內源性干細胞歸巢中發揮著重要作用，且主要與生長因子及干細胞表面受體的表達相關。具有補腎功效的中藥牛膝提取物杯莧甾酮能夠上調干細胞CXCR4的表達，進而激發大鼠BMSCs體外遷移[18]。補腎中藥淫羊藿提取物淫羊藿苷也具有促進MSC遷移的能力，進一步實驗運用CXCR4的拮抗劑AMD3100處理后，這種遷移能力被阻斷[19]。此外，補腎中藥熟地提取物[20]、骨碎補總黃酮[21]、骨碎補柚皮苷[22]均能夠上調SDF-1/CXCR4的表達，進而促進干細胞的遷移。趙志虎等[22]的研究進一步表明，骨碎補柚皮苷促進MSC遷移的能力可能通過SDF-1α/CXCR4/PI3K/Akt信號通路實現。以上結果證實了補腎中藥可促進內源性干細胞的遷移，而這種能力與SDF-1/CXCR4軸密切相關。

3.1.2補腎方劑促內源性干細胞歸巢：內源性干細胞歸巢能力減弱是引起OP的重要因素。補腎方劑在促進內源性干細胞歸巢、抗骨質疏松中發揮著重要作用。王華偉等[23]的研究表明，補腎化瘀生新方可能通過促進BMSCs歸巢參與了組織的修復。此外，補腎益精方[24]、補腎活血湯含藥血清[25-26]均被證實能夠啟動SDF-1/CXCR-4信號軸促進BMCs的遷移。

研究發現，補腎活血湯促進BMSCs的能力與單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和趨化因子受體-2(CC chemokine receptor 2，CCR2)相關[27]。吳志方等[28-29]的研究表明，補腎活血湯4種有效提取物(石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物)均能促進大鼠BMSCs體外遷移，這種促進遷移的能力可能與MCP-1/CCR2上調Wnt5a的表達有關。黃永銓等[30]的研究也表明，補腎活血湯的促MSCs體外遷移能力可能與MSCs表面的受體CCR2相關。此外，蔡炎等[30]的研究則表明，這4種提取物在具備各自最佳濃度時均可成為活性部位，且可能通過BMSCs表面相關受體人胰島素樣生長因子2受體提升遷移能力。石油醚部位提取物還可能通過下調miR-539及靶向Wnt5a信號通路促進MSCs遷移[31]。錢偉宏等[32]的研究表明，補腎活血湯還可能通過CXCL13/CXCR5信號軸及SDF-1/CXCR4信號軸參與了BMSCs遷移的促進。

溫陽補腎方在促干細胞歸巢、抗OP中也發揮著重要作用。血小板衍生生長因子(platele derived growth factor，PDGF)已被證實可促進內源性MSC遷移[33]。相關實驗已經證明，將VCAM-1抗體與小鼠MSC表面結合能促進MSC向骨髓的歸巢。吳多藝等[34]、羅賢紅等[35]分別對146例、60例骨質疏松骨折恢復期患者隨機分組，運用中醫溫陽補腎方治療3個月、1個月后均發現，患者的血清骨鈣素、PDGF與類胰島素一號生長因子顯著升高，血清VCAM-1降低，骨密度增加，提示溫陽補腎方可促內源性干細胞歸巢，從而促成骨，提高骨密度，且與PDGF、VCAM-1密切相關。

此外，“補腎活血舒筋方”也具有促進BMSCs遷移的能力，且可能與NF-κB、CXCR4有關[36]。補髓生血顆粒也能夠促進細胞的遷移，這可能與調控Src/PLC/IP3通路及調控異常Ca2+[37]或調控FAK/PI3K通路及Rho GTP酶有關[38]；也可能與調節VLA-4和VLA-5 mRNA相關[39]。

以上大量的研究證實了補腎中藥及補腎方劑能夠通過調節干細胞歸巢的各個階段促進內源性干細胞的歸巢。

3.2 補腎法促外源性干細胞歸巢

OP患者處于疾病狀態，內源性干細胞功能不足或缺乏，因此，外源性移植是較好的治療策略[17]。補腎法在促外源性干細胞歸巢中發揮著重要作用，徐志明等[40]等運用補腎活血湯聯合靜脈注射PKH26標記的BMSCs發現，補腎活血湯促進移植后的外源性BMSCs向大鼠骨折斷端遷移。筆者的前期研究[41]運用補腎中藥龜板灌胃聯合靜脈注射BrdU標記的BMSCs發現，龜板顯著促進了外源性BMSCs歸巢，減少了椎體骨量的丟失，對絕經后骨質疏松起到了有效預防作用。以上研究提示補腎法能夠有效促進外源性干細胞的歸巢。

綜上，補腎法能夠促進內源性干細胞及外源性干細胞的歸巢，更好發揮出干細胞的治療作用。

3.3 補腎法促干細胞歸巢抗OP的機理

《類經》云：“陽動而散，故化氣，陰靜而凝，故成形?！备杉毎臍w巢與“陽化氣”有著密切的聯系，補腎法促干細胞歸巢治療OP的關鍵在于“補腎陽”，增強“陽化氣”的功能，使得“陽生陰長”，增加骨量抗OP。

“補腎”在促干細胞遷移中發揮著至關重要的作用。李杰斌等[42]研究證實，補腎益精方左歸丸能夠調控衰老大鼠BMSCs歸巢，且檢測到干細胞生長因子分泌的增加。補腎法能夠通過調控SDF-1/CXCR4軸改善骨的損傷，Lien等[43]將表達CXCR4的MSCs分別經髓內和尾靜脈注射入免疫活性C3H/HeN小鼠體內后發現，其歸巢率和骨量保留率較高，提示補腎法可促進MSCs歸巢抗免疫保留骨量。此外，小劑量BMP-2和SDF-1α聯合應用可增加損傷部位原代MSCs募集來促進骨愈合[44]。而將CXCR4和一種成骨分化調節的主轉錄因子核心結合因子——核結合因子α1共轉染在BMSCs上，也增強了BMSCs對OP的治療作用[43]。SDF-1/CXCR4在啟動成骨過程中起著重要作用[45]，而成骨分化途徑啟動后，SDF-1/CXCR4軸將不再需要[10]。這些結果表明，補腎法通過SDF-1/CXCR4軸促進了MSCs的歸巢，且參與了成骨。但歸巢的MSCs在分化過程中并不同步[46]，可能是因為在治療的不同階段遷移到缺陷部位，從而處于不同的分化階段。汪偉等[15]的研究進一步表明CXCL12基因轉染可在早期促進MSCs向成骨細胞分化，而在MSCs向成骨細胞分化的中后期無明顯影響。李汪洋等[47]的研究則表明補腎活血湯在骨折不同時期發揮的促遷移作用趨勢并不一致，早期和晚期分別以低濃度、高濃度作用明顯促進，而中期則是抑制，這種趨勢不一致與CCL12/CXCR4的表達有著密切關系。這些結果表明促進遷移后，干細胞將進行成骨的相關表達，在短期降低遷移，而后增加補腎力度可再次促進干細胞的歸巢。

Sui等[14]將綠色熒光蛋白(GFP)標記的骨髓間充質干細胞(BMSCGFP)注射到小鼠體內后發現BMSCGFP輸注以部分凋亡為代價阻止了內源骨髓細胞凋亡，且BMSCGFP的凋亡率小于30%，其余大部分BMSCGFP仍能繼續發揮作用，且在4周后歸巢定居后的大約40%的BMSCGFP接受成骨分化為Osx+成骨細胞祖細胞，提示補腎法可能促MSCs歸巢抗凋亡促進成骨的作用。

以上的補腎中藥及方劑均能在一定程度具有溫補腎陽的作用。綜上，SDF-1/CXCR4信號軸促進干細胞遷移能力與補腎法中的“陽化氣”功能具有較多相似的內涵，是補腎法“陽化氣”功能在分子水平的表現形式。因此，本研究認為補腎法能夠通過激發干細胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4信號軸促進MSCs的歸巢，并可能通過參與抗免疫、抗凋亡或直接成骨分化防治OP。

4 小結及展望

干細胞治療是當下研究的熱點，干細胞具有“腎精”屬性。補腎法能夠激發干細胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4軸，促進干細胞歸巢防治OP。歸巢后的干細胞可通過調節骨免疫、抗凋亡等途徑為具有“陰成形”特征的骨形成創造有利環境或成骨分化直接參與成骨抗OP。以往的研究表明了補腎法在促干細胞歸巢中的重要作用，但依舊有許多問題有待解決。如：(1)MSCs的骨歸巢仍未有公認遷移分子且歸巢機制不明；(2)MSCs移植后的“肺首過效應”“血液清除”效應難以避免，降低了歸巢效率；(3)補腎中藥成分眾多，有效成分提取及鑒定存在困難；(4)MSC歸巢過程及歸巢后行為機制尚不完全明確；(5)MSCs遷移能力與成骨分化的相互作用機制研究較少；(6)內分泌、旁分泌效應如何影響干細胞歸巢研究較少。

針對這些問題，通過補腎法促進MSCs歸巢促進骨再生研究的前景包括：(1)構建熒光標記MSC，利用成像系統實時觀察MSC在體內的遷移，為MSC在體內的遷移提供直接證據并尋找遷移因子；(2)探索“肺首過效應”及“血液清除”的機制，為提高干細胞歸巢效率提供參考；(3)進一步開展中藥有效物質提取及鑒定的研究；(4)結合當下MSCs內分泌、旁分泌研究熱點進一步探討MSCs的歸巢及歸巢后成骨分化機制；(5)進一步發掘和完善干細胞歸巢的中醫理論基礎。