高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌的研究進展

王海日罕，多麗波

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150086)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬于腸桿菌目，是一種常見的條件致病菌和醫院感染菌，可引起肺炎、尿路感染、菌血癥和化膿性肝膿腫等多種感染。根據毒力和致病特點可將KP分為“經典”肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumonia, hvKP)?？蓪е箩t院感染是cKP的主要特征之一，通常感染有免疫缺陷或免疫低下的人群，其攜帶的毒力基因較少，致病力較弱，但對抗菌藥物可以表現為高水平的多重耐藥，已成為世界衛生組織重點關注的對象。而hvKP常表現為社區獲得性感染，且越來越多地引起醫院感染，通常更易造成健康人群發病。1986年hvKP在中國臺灣首次被發現，在沒有任何肝膽危險因素的社區來源患者引起化膿性肝膿腫。研究者很快發現，這種KP具有高侵襲性，能向遠處轉移，最常見的轉移部位包括眼、肺、肝、全身軟組織和中樞神經系統，臨床上稱之為侵襲綜合征，且預后差，病死率高，治愈后也可能有較重的后遺癥。雖然hvKP最初主要在東南亞發現，但現在全世界報道的病例越來越多，包括歐洲和美國，而中國是hvKP感染高發地區[1]。此外，hvKP在過去對抗菌藥物非常敏感，然而這些菌株也開始表現為高度耐藥，因此hvKP的臨床環境正在發生巨大的變化，對治療提出了新的挑戰。

1 hvKP的鑒定和毒力因子

1.1 鑒定 目前對于hvKP的定義尚無統一標準，過去常采用拉絲試驗鑒定，即當一個菌落可以通過接種環拉伸至少5 mm時，該菌株被定為hvKP。但是，并非所有的hvKP都具有高黏液表型，且并非所有的高黏液表型菌株都是hvKP。隨著研究的進展，目前常見以下幾種定義方法：(1)臨床上具有侵襲綜合征表現；(2)拉絲試驗陽性株；(3)莢膜血清型K1/K2；(4)毒力基因RmpA/RmpA2陽性株；(5)毒力基因aerobactin陽性株。滿足上述兩條及以上即可判定hvKP感染。

1.2 毒力因子

1.2.1 莢膜(capsule, CPS) CPS覆蓋在細菌的表面起保護作用，是KP重要的毒力因子?？梢酝ㄟ^抗吞噬、抵抗多種抗菌肽、抑制補體和宿主炎癥反應來增加KP的生存能力和傳播能力，從而造成侵襲性感染。

1.2.1.1 CPS基因構成 CPS主要成分是一種酸性脂多糖，由3～6個糖重復單元組成，并通過Wzy聚合酶依賴途徑合成。CPS編碼基因位于染色體操縱子cps上，大小為12～30 kb，含有16～25的基因，參與CPS合成、聚合、裝配等，cps基因簇中wza、wzb、wzc、wzi、gnd、wca、cpsB、cpsG和galF參與莢膜合成；wzy(也稱為orf4)、cpsB和cpsG參與莢膜聚合物的合成，cpsB和cpsG分別通過編碼甘露糖-1磷酸鳥嘌呤轉移酶和磷酸甘露糖突變酶，參與莢膜多糖的聚合反應；wza、wzc、orf5和orf6參與莢膜表面組裝；wzi基因編碼一種表面蛋白，有助于莢膜黏附在外膜上[2]。

1.2.1.2 CPS調控基因 CPS合成受多種調控基因調控，研究較多的主要有黏液表型調節因子A(regulator of the mucoid phenotype A,rmpA)和黏液相關基因A(mucoviscosity-associated gene A，magA)，以及轉錄調控因子RcsAB。

rmpA于1989年首次被發現，大小為636 bp，編碼137個氨基酸的蛋白質，調控莢膜合成，促進黏液表型形成并增強菌株毒力。rmpA2于1993年被發現，與rmpA有80%的同一性，大小為411 bp，編碼212個氨基酸的蛋白質。編碼rmpA/rmpA2的基因有三個：rmpA既可位于染色體(c-rmpA)，也可位于質粒(p-rmpA)，而rmpA2只位于質粒(p-rmpA2)。Cheng等[3]的研究顯示KP CG43，p-rmpA和p-rmpA2均促進莢膜生成。而在另一項報道中，Hsu等[4]將NTUH-K2044菌株和c-rmpA、p-rmpA、p-rmpA2基因缺失株分別進行比對，表明僅p-rmpA會增強莢膜多糖合成基因的表達和CPS生成。因此，rmpA在毒力形成中的作用仍需進一步研究證實。雖然92%～100%hvKP呈rmpA陽性[1]，但rmpA與高黏液表型的聯系并不是絕對的，一些rmpA陽性菌株缺乏高黏液表型且毒力低，可能是由于在無c-rmpA的情況下，rmpA和rmpA2基因同時發生突變引起[5]。

magA于2004年初次報道，大小為1.2 kb，編碼408個氨基酸的蛋白質，作為血清型K1的cps基因簇中的聚合酶基因wzy負責K抗原的合成，形成黏性的胞外多糖網狀結構，具有抗吞噬、抗血清補體殺菌作用，現將magA重命名為wzy_K1[6]。

Rcs磷酸化系統(Rcs phosphorelay system)是一種信號轉導系統，包括RcsA、RcsB、RcsC和RcsD。RcsAB形成一種非典型的雙組分調節系統，可以調節莢膜多糖的生物合成，并與KP的毒力相關。Peng等[7]比較了NTUH-K2044以及RcsAB敲除和補充菌株，結果顯示NTUH-K2044ΔRcsAB株的毒力、生物膜形成和CPS水平下降。而后在NTUH-K2044ΔRcsAB的質粒上引入RcsAB片段，顯示菌株的毒力、生物膜和CPS合成得到部分恢復。表明RcsAB基因可能影響KP的CPS形成和毒力。另外，RcsAB還通過直接與galF啟動子DNA結合，正向調節galF基因的轉錄，進而影響KP的CPS形成。

另外一項新研究[8]發現轉錄調節因子kvrA、kvrB也參與激活染色體上莢膜合成基因的轉錄，而敲除這兩個基因的ΔkrvA、ΔkrvB菌株莢膜產量減少了40%，及其毒性也不如野生型。

1.2.1.3 CPS類型(Capsule type K) 因遺傳差異而導致的不同多糖變體被稱為K抗原，可以分為多種莢膜類型。據統計，目前根據莢膜多糖可以將KP至少分為82個血清型，其中與hvKP相關常見的血清型依次為K1、K2、K5、K20、K54和K57[9]，而K1與K2型通常被認為是引起侵襲綜合征的關鍵毒力因子。盡管K1/K2型約占hvKP的70%[10]，但莢膜類型并不能完全解釋高毒力。研究[11]顯示，將毒性較弱的菌株莢膜相關基因敲除，并替換為來自K1的同源基因后，用于莢膜合成的同源基因未能表現出相同功能，并且根據基因的同源性不同程度地降低了毒力，表明莢膜并不是毒力的唯一因素。

1.2.1.4 CPS類型與多位點序列分型(multi-locus sequence typing,MLST) KP的基因組結構多樣，可分為多個譜系，因此臨床上通常采用MLST對其進行分類，通過擴增KP的7對管家基因，與MLST數據庫進行比對，得到菌株相對應的序列類型(sequence type, ST)。其中，hvKP最常見的序列分型為ST23型，也是導致肝膿腫的主要類型，而cKP最常見的序列分型為ST11型[12]。研究[13]表明，來自肝膿腫患者的KP菌株中有57.8%屬于ST23型，而這些ST23型KP中96.2%是K1血清型。K1血清型與ST23相關的原因尚不清楚。同時，K2血清型的hvKP菌株具有遺傳多樣性，一項研究[14]在血清型K2分離株中發現了8種不同的序列類型：ST86(46%)、ST65(42%)、ST66、ST373、ST374、ST375、ST380和ST434。值得注意的是，K1 ST23 型hvKP與化膿性肝膿腫相關，而K2 ST65型 hvKP與各種侵襲性感染相關[15]。

1.2.2 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) LPS是革蘭陰性菌細胞壁主要成分，也被稱為內毒素，能夠引起患者發熱、白細胞反應、出血傾向等。從外到內依次為O抗原、核心多糖、脂質A，每個組分具有不同的功能[2]。O抗原可阻止補體C1q和C3b與細菌結合，阻止細菌裂解，在KP中有9種O抗原，最常見的是O1。核心多糖具有抗吞噬作用，有助于細菌定植。脂質A有助于抵抗宿主天然免疫，尤其是抵抗抗菌肽作用。cKP和hvKP菌株均具有完整的LPS，目前尚未發現hvKP的LPS產生了獨特的結構特征使菌株毒力增強。

1.2.3 黏附素(adhesin) 黏附素有助于KP定植，可以分為菌毛和非菌毛，目前發現的主要有1型菌毛(T1P)、3型菌毛(T3P)、Kpc菌毛、KPE-28菌毛、ECP和CF29K等，其中最重要的是T1P和T3P[16]。T1P由FimH編碼，介導細菌與宿主細胞(甘露糖)結合，從而導致泌尿道感染。T3P由MrkABCD編碼，MrkA直接結合到非生物表面，介導KP黏附到氣管內導管，MrkD結合到膠原質或支氣管細胞衍生的細胞外基質表面，均與肺部感染相關。hvKP中，這些菌毛與非菌毛型黏附素均促進生物膜的形成，有助于細菌定植與侵襲，從而使菌株毒力增強。

1.2.4 鐵獲取系統 鐵是人體和細菌生長發育的關鍵元素，由于Fe3+在生理條件下不溶解及人體對Fe3+、Fe2+的限制，導致組織和血清中游離鐵的含量極低。鐵的獲取通常受到一組相對協調的蛋白質的限制，而在人體感染期，這些蛋白會在一種被稱為營養免疫的過程中更加嚴格的限制生物可利用的鐵[17]。因此，入侵人體的病原體需要編碼高親和力的鐵獲取系統來對抗宿主的營養免疫。

鐵載體是細菌合成并分泌的小分子物質，在細胞外鐵載體以極高的親和力與鐵結合，并將鐵轉運回細胞內，為細菌提供生長所需的鐵。一項鐵載體定量檢測顯示，在鐵缺乏的培養基或人的腹腔積液中，hvKP產生的鐵載體比cKP高6～10倍[18]。當某菌株鐵載體總量達30 g/mL時，可增加小鼠感染模型的致死率，預示著該菌株為hvKP，這可能是hvKP獲得高毒力的機制之一。目前已知有4種鐵載體，包括腸桿菌素(enterobactin)、耶爾森菌素(yersiniabactin)、沙門菌素(salmochelin)和氣桿菌素(aerobactin)。研究[19]表明，耶爾森菌素、沙門菌素和氣桿菌素在hvKP中更常見。

1.2.4.1 氣桿菌素 氣桿菌素由iucABCD編碼，是一種氧肟酸鹽與羧酸鹽混合型鐵載體，位于大多數cKP菌株中不存在的大毒力質粒(pLVPK)上[20]，因此在cKP菌株中極少表達氣桿菌素，但在大多數hvKP中都存在。其具有較低的鐵親和力，但占鐵載體總量的90%以上。Russo等[18]敲除iuc基因后，發現hvKP1ΔiucA鐵載體總量減少94%以上，其離體生長存活率也明顯低于hvKP1。且感染hvKP1ΔiucA的小鼠死亡率明顯低于hvKP1組。分析來自香港、新加坡和臺灣的47株K1型KP時，所有具有50%致死劑量<102菌落形成單位的菌株均攜帶氣桿菌素[21]。這些數據支持了氣桿菌素與hvKP毒力相一致，有望成為準確檢測hvKP的生物標志物。

1.2.4.2 其他鐵載體 腸桿菌素由超過90%的腸桿菌目細菌產生，是一種典型的鄰苯二酚鹽型鐵載體蛋白，對鐵的親和力最高，但受到宿主脂質轉運蛋白2(Lcn2)抑制，該蛋白能與攜帶鐵的腸桿菌素結合，并阻止其返回細胞，以阻礙細菌獲取鐵。腸桿菌素由entABCDEF編碼，其過度表達可使細菌攜帶更多的鐵載體進而獲得更多生命所需的鐵，從而增強細菌毒力。沙門菌素是一種鄰苯二酚型鐵載體，是經c-葡糖基修飾的腸桿菌素，對鐵親和力較高，由iroBCDN編碼，與氣桿菌素編碼基因位于同一個大毒力質粒上。耶爾森菌素首次在耶爾森菌中發現，是一種主要為酚鹽和羧酸鹽的混合型鐵載體，具有中等水平的鐵親和力，由ybt編碼合成。耶爾森菌素和沙門菌素能夠抵抗脂質轉運蛋白2，有助于hvKP獲取更多的鐵，從而增強細菌毒力。

1.2.5 PEG-344 Bulger等[22]通過轉錄組序列技術發現了一種新型毒力因子(將其命名為PEG-344)，位于hvKP1毒力質粒上，在hvKP菌株中廣泛流行。該研究敲除PEG-344基因，比較hvKP1及hvKP1ΔPEG-344在各種培養基中以及在小鼠感染模型中的生長和存活情況。與hvKP1相比，在人腹腔積液中觀察到hvKP1ΔPEG-344的存活率下降，但對補體殺傷能力有相似的抵抗力。受到hvKP1ΔPEG-344攻擊的小鼠的死亡率較低，且死亡時間也較晚。PEG-344可能充當內膜轉運蛋白，可以轉運腹腔積液中存在的未知生長因子。Russo等[23]從北美洲和英國收集了85株hvKP和90株cKP菌株，顯示PEG-344作為標志物鑒定hvKP的準確度、靈敏度和特異度分別為97%、99%、96%。表明PEG-344似乎是hvKP特異的，因此具有快速鑒定hvKP的潛在用途。

1.2.6 CRISPR_CAS系統 成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相關序列(CRISPR-associated sequences,CAS)組成的CRISPR_CAS系統于1980年發現，是廣泛存在于細菌和古細菌中的一種適應性免疫調節系統，經CRISPR-RNAs指導抵御入侵的核酸為細菌和古細菌提供了對病毒和質粒的適應性免疫力[24]。CRISPR_CAS系統與細菌毒力和耐藥有關，但具體機制不詳。宋國濱等[25]收集了61株KP，研究證明CRISPR_CAS系統陽性菌株的毒力基因rmpA、aerobactin、Kfu檢出率為81.8%，alls、wcaG、magA檢出率為45.5%，明顯高于CRISPR_CAS系統陰性菌株，與杜芳玲等[26]的研究結果一致。

1.2.7 其他毒力因子 還有一些尚未被研究透徹的毒力因子，如wcaG，編碼莢膜巖藻糖合成，能夠抗吞噬；鐵離子獲取因子kfu，是磷酸糖磷酸轉移酶系統中的一種成分，廣泛存在于hvKP菌株中；alls基因可使攜帶菌株將尿囊素厭氧同化作用作為其生長繁殖的唯一碳源、氮源和能量來源，因而與hvKP的致病能力密切相關。這些因子的致病機制還有待進一步研究。

2 高耐藥和高毒力的重疊

在hvKP出現后的最初幾十年，除了對氨芐西林天然耐藥外，hvKP對抗菌藥物廣泛敏感。隨著廣譜抗菌藥物廣泛大量應用，臨床開始出現多重耐藥(multidrug resistance, MDR)、廣泛耐藥(extensively drug-resistence, XDR)，甚至于泛耐藥(pan-drug resistance, PDR)的KP。產超廣譜β-內酰胺酶、產頭孢菌素酶及耐碳青霉烯類KP的陸續出現，使得高耐藥KP成為醫院感染的重要致病菌，而高毒力、高耐藥的KP更加成為目前臨床關注的重點。2020年，Liu等[27]在北京兩所醫院進行了一項回顧性研究，顯示43.1%的hvKP為MDR或XDR。

2.1 產超廣譜β-內酰胺酶hvKP(ESBLs-hvKP) ESBLs(如CTX、SHV、OXA和TEM)是一種經修飾的廣譜β-內酰胺酶，由革蘭陰性桿菌產生、質粒介導的絲氨酸蛋白衍生物，可水解青霉素、單酰胺類藥物和第一、二、三代頭孢菌素及第四代頭孢菌素(在某些情況下)。1992年，Vernet等[28]收集法國190株ESBLs陽性KP菌株，氣桿菌素和高黏液表型分別占3.7%、7.0%，而且有2.0%的菌株同時具有雙毒力因子。2008年，Su等[29]在臺灣三軍總醫院報道了一株產ESBLs的hvKP菌株。2014年，Liu等[30]在中國北京朝陽醫院發現了幾株引起血流感染的ESBLs-hvKP菌株。2020年，Liu等[27]收集了79株hvKP，顯示39.2%表達ESBLs。

2.2 產頭孢菌素酶hvKP(AmpC-hvKP) AmpC是由革蘭陰性桿菌產生的又一類重要的β-內酰胺酶，AmpC高水平的表達，與ESBLs具有相同的作用，還可以水解頭霉素(如頭孢西丁和頭孢替坦)。部分KP菌株，包括hvKP，獲得了含有AmpC酶基因的質粒。2018年，Xu等[31]分離出一株K1 ST23型hvKP，全基因組測序分析表明，該菌株同時攜帶多種毒力基因和耐藥基因，其中包括AmpC酶DHA基因。同年，Xie等[32]在對一株K1 ST23型hvKP進行全基因組測序表明，該菌株基因組同時包含耐藥質粒和毒力質粒，在耐藥質粒上發現了DHA-1基因。

2.3 耐碳青霉烯類hvKP(CR-hvKP) 碳青霉烯類抗生素可用于治療產ESBLs和產AmpC的菌株，曾被稱為治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線。碳青霉烯類抗生素越來越多的用于治療產ESBLs細菌，逐漸出現耐藥性，KP成為最常見的耐碳青霉烯類腸桿菌。CRKP意味著泛耐藥，治療方案有限，患者病死率高。而CR-hvKP同時具有毒力高、耐藥廣、傳播強的特點，臨床治療失敗概率大，容易發生醫院感染，目前已有報道顯示CR-hvKP在醫院引起暴發感染。碳青霉烯酶[例如，KPC(A類)、NDM、VIM和IMP(B類)、OXA(D類)]是腸桿菌目對碳青霉烯類耐藥的重要機制。2015年，Yao等[33]報道33例感染CRKP的患者分離出7株hvKP，且其中有6株產KPC-2。2016年，Zhang等[34]報道了浙江省某醫院7株耐碳青霉烯類的K1型hvKP，其中有6株產KPC-2。2017年，Zhang等[35]收集了140株CRKP，發現21株hvKP且全部產KPC-2。研究[1]顯示中國CRKP菌株中hvKP的流行率顯著增高，為7.4%～15.0%，產KPC-2的hvKP中ST11型和ST23型的比率分別為50.0%、8.3%。這些結果意味著產生KPC-2的ST11型cKP和ST23型hvKP之間的移動遺傳元件的交換已經發生。目前已經發現兩種類型的接合：獲得毒力基因或整個毒力質粒的cKP和獲得染色體或質粒編碼的抗菌藥物耐藥基因的hvKP。另外外膜蛋白缺失/表達下降或合并高產AmpC酶或ESBLs、外排泵的高度表達、生物膜的形成也是hvKP產生碳青霉烯類耐藥的重要機制。

2.4 CRISPR_CAS系統 杜芳玲等[26]研究顯示CRISPR_CAS系統陰性的菌株耐藥率較CRISPR_CAS系統陽性的菌株高，其中耐藥基因blaKPC、blaSHV、qnrS差異有統計學意義。應警惕的是CRISPR_CAS系統陰性菌株獲得毒力質粒，成為高毒力、高耐藥、高傳播性，引起醫院暴發感染的超級細菌。

3 結語

hvKP早期報道主要集中在亞洲，而如今hvKP已擴散至全球，應該認識到社區感染hvKP對健康個體的威脅。目前已發現rmpA/rmpA2、iuc、PEG-344可用作hvKP鑒定的生物學標志物，但hvKP還有很多致病機制尚未被發現，需要對hvKP毒性決定因素有一個全面的認識，以改進診斷并確定新的抗菌靶點。高耐藥hvKP流行病學的明顯變化，部分是現有高耐藥ST11型cKP獲得毒力質粒的結果。具有耐藥基因和毒力增強的ST11菌株將具有更強的生存能力，并在醫療環境中引起感染。在無臨床微生物學實驗室對hvKP進行常規檢測的情況下，確診感染非常困難。因此，臨床醫生要意識到hvKP不僅在社區環境中引起感染，而且在醫療衛生環境中也能引起感染，而且對這種新型的MDR/XDR hvKP進行監測是至關重要的。