新型疫苗佐劑的研究進展

張 榮，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，劉學榮

（中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

疫苗接種目前仍然是預防疫病的主要措施，為有效防控傳染病和畜牧業的有機發展提供了有力保障。隨著免疫學和基因工程技術的不斷深入及快速發展，DNA疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗的研究也邁上了新的臺階，但是這些疫苗普遍存在免疫原性差的問題，因此，需要合適的佐劑來增強其免疫應答，提高機體保護力，減少疫苗用量，降低生產成本。傳統佐劑，如鋁鹽佐劑，只能誘導體液免疫應答，不能誘導細胞免疫和細胞毒性T細胞應答，質量難以控制。為了突破這種限制，對新型疫苗相對應的安全有效佐劑的研發迫在眉睫。新型佐劑種類比較多，無統一的歸類方法。根據佐劑的作用機制、研究現狀及優缺點，將其分為免疫調節分子類佐劑、抗原遞送系統類佐劑及前兩種類型佐劑的聯合類佐劑三種。下面從這三個方面做綜述，為新型佐劑研究提供文獻參考。

1 免疫調節分子類佐劑

免疫調節分子是由細胞分泌的某些物質，該類分子作為佐劑是通過直接作用于免疫系統，刺激相關免疫細胞的增殖和分化，從而增強抗原特異性免疫應答。選擇具有免疫調節作用的佐劑將給新型疫苗的發展提供很大的助力。

1.1 CD40抗體佐劑

CD40是免疫應答中重要的共刺激分子，能很好地促進B細胞活化增殖和信號轉導，通過激活CD40信號通路來增強抗原的免疫應答。將抗CD40抗體與抗原結合，發現這種結合可增強與其共軛相連的抗原的免疫原性和記憶性抗體的應答反應[1]。有研究發現，CD40抗體可以為B細胞提供CD40信號，增強與其共軛相連的抗原的免疫原性，可作為潛在的佐劑[2]。Ninomiya等[3]發現CD40抗體可增強記憶性抗體應答反應，同時還能促進T細胞的增殖，增強T細胞應答反應并引起遲發型超敏反應等。此外，CD40抗體其抗原表達與抗體制備過程相對簡單、毒性小，是一種新型、有潛在價值的免疫佐劑，但目前僅限于實驗室階段。

1.2 CpG-ODNs佐劑

CpG寡脫氧核苷酸（CpG Oligonucleotide，CpG-ODN）是指人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸序列，與天然CpG模式識別受體有相似的免疫反應，能顯著促進機體的特異性及非特異性免疫應答，是一種高效的Thl型疫苗佐劑[4]。作為TLR9的激動劑，CpG-ODN可通過TLR9介導的信號級聯反應，直接活化DC和B細胞或間接活化NK細胞和T細胞，將體內的免疫環境向Th1型免疫類型轉化[5]。用結合了CpG-ODN的豬偽狂犬病弱毒疫苗免疫新生仔豬，與單獨接種豬偽狂犬病弱毒疫苗的仔豬相比，血清IgG滴度與粘膜IgA水平均提高了10倍以上[6]。CpG-ODN具有較強的免疫刺激作用和促進Th1型免疫應答的特點，能增強多種抗原所誘導的免疫反應，因此成為目前被廣泛關注和研究的一種新型佐劑，但CpG-ODN在體內不穩定且可誘發自身免疫性疾病。

1.3 細胞因子佐劑

細胞因子是被抗原刺激后機體細胞產生的小分子可溶性多肽蛋白類物質。細胞因子有多種免疫調節功能，跟其他佐劑相比具有更獨特的優勢，是目前應用最廣的一類分子調節佐劑。例如白細胞介素（Interleukin，IL）、干擾素（Interferon，IFN）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）及趨化因子（Chemotactic）等。

白細胞介素IL中佐劑效應明顯的當屬IL-2。Hu等[7]研究發現，IL-2能有效增強小鼠骨髓細胞的成熟。除IL-2之外，IL-12、IL-21、IL-22也具有一定的佐劑效應來增強細胞免疫反應[8～10]。干擾素中的IFN-γ可增加抗原遞呈細胞中MHC分子的表達，誘導Th1類應答，增強B細胞和NK細胞活性。用含有IFN-γ佐劑的弓形蟲可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen，STAg）免疫小鼠發現IFN-γ可誘導產生高水平、長時間的sIgA和IgG抗體免疫應答[11]。將含卵清蛋白OVA的殼聚糖水凝膠和GM-CSF聯合皮下注射小鼠，發現與對照組相比含GM-CSF的組OVA特異性抗體水平更高，增強了機體的體液和細胞免疫應答[12]。將趨化因子作為疫苗佐劑發現可以增強Th1和Th2型細胞的應答，如CCL20、CCL27以及CCL28等。有研究者將CCL27或CCL28作為DNA疫苗的佐劑，肌注小鼠發現外周IFN-γ和抗原特異性IgG都會升高，從而刺激腸相關淋巴組織和肺臟特異性T細胞分泌細胞因子，產生中和抗體[13]。

盡管大多數細胞因子活性易受內環境、水解酶等因素影響且體內半衰期較短，但通過對細胞因子的深入研究，這些問題也在不斷得到解決，作為疫苗佐劑細胞因子有很大的潛力。

1.4 皂苷佐劑

皂苷（Saponins）是螺旋甾烷類化合物或三萜的天然糖苷，可激活哺乳動物的免疫系統。天然植物中提取的皂甙與細胞膜上的膽固醇形成復合物，共同促進T、B淋巴細胞增殖，誘導產生特異性MHC-I抗原限制性CTL，刺激分泌多種細胞因子，因此可以作為佐劑使用。

QuilA及衍生物QS-21是具有佐劑活性并應用最廣的皂苷類佐劑，可以用來修飾T細胞和抗原呈遞細胞。QuilA既能使外源性抗原刺激機體Th1免疫應答，也能誘導CTL應答，目前已成為亞單位疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑[14]。Qu等將弓形蟲重組蛋白ROP18與人參皂苷Re聯合免疫小鼠，發現添加人參皂苷Re可使ROP18誘導產生更強的體液和細胞免疫反應。Brunner等[15]將QS-21包裹于脂質體中發現可以消除溶血作用并保留其佐劑效果。因此，新型皂苷佐劑的進一步研究對現代疫苗的開發起至關重要的作用。

1.5 細菌毒素

細菌毒素中的霍亂毒素（CT）、大腸桿菌不耐熱毒素（LT）、卡介苗（BCG）及脂多糖（LPS）等都可有效促進抗原特異性免疫應答[16]。Lycke等發現，將CT與LT分別與抗原合用口服免疫，可刺激腸道上皮細胞，引發B細胞生成IgA、T細胞增殖，從而增強免疫反應[17]。Iljine等[18]發現，BCG可以促進GM-CSF分泌、TNF-α基因轉錄及蛋白釋放，增強巨噬細胞無絲分裂早期的活動。單磷酰脂質A（MPL）是一種被化學和遺傳修飾后低毒的細菌性脂多糖，屬于TLR4激動劑，可刺激巨噬細胞產生TNF，MPL和TNF共同促使NK細胞產生IFN-γ，選擇性激活Th1細胞。Lu Y等[19]將低免疫原性的結核分枝桿菌（Mtb）抗原ESAT-6與MPL/DDA結合免疫小鼠評價MPL佐劑效應，結果表明添加了MPL佐劑的實驗組可誘導產生更強的Th1應答和高滴度IgG1 IgG2b抗體。Kim等[20]用單磷酰脂A和脂質體包裹口蹄疫病毒樣顆粒免疫小鼠發現可以促進對口蹄疫病毒的細胞和體液免疫。MPL作為佐劑已被證明在過敏疫苗、癌癥疫苗和致病菌等一系列疫苗中有效，一般都是跟其他佐劑復合作用。

2 抗原遞送系統類佐劑

抗原遞送系統類佐劑通過控制物質釋放促進對抗原、免疫調節分子或兩者聯合的有效遞送來增強抗原的免疫原性。通過改變抗原或免疫調節分子的物理性狀，控制抗原在體內的釋放時間及靶向性，提高弱免疫原的有效刺激，增強免疫應答。

2.1 脂質體（Liposome）

脂質體是由非免疫原性和可生物降解的單層磷脂或連續多層磷脂組成的、能包裹抗原的球體，含有抗原載體和佐劑雙重身份。被脂質體包裹的抗原通過與巨噬細胞膜融合后將抗原遞送入細胞質內，增強巨噬細胞吞噬作用和抗原提呈作用，經MHCⅠ類途徑激活CD8+T細胞。將OVA分別與免疫增強劑PAM和CpG-ODN寡核苷酸包裹于脂質體中免疫小鼠，發現與未包裹脂質體的PAM組相比，包裹于脂質體的PAM刺激DC細胞成熟能力更強[21]。脂質體能靶向免疫細胞，促進抗體交叉表達，作為佐劑雖然具有多功能性和可塑性，但由于在注射部位可能會引起疼痛癥狀，且脂質體穩定性低、成本高，不宜用于規模化生產。

2.2 免疫刺激復合物（Immunostimulating complex，ISCOM）及基質

ISCOM是由抗原、磷脂、膽固醇、QuilA組成的、粒徑約40 nm的、具有較高免疫活性的脂質小泡，產生免疫應答的效力較全面，能延長抗原的存留時間，長期增強特異性抗體應答。ISCOM可以使APC攝取疫苗中的抗原，產生滴度高、較持久的抗體以及較強的Th以及CTL免疫應答，從而激活機體體液和細胞免疫應答。將含前S表位重組乙肝表面抗原和ISCOM佐劑聯合肌肉注射小鼠，與Al（OH）3對照組相比能產生更高的抗體效價，具有更強的免疫增強作用[22]。ISCOM基質（ISCOM-matrix）不含抗原，且無毒副作用可單獨作為良好的候選佐劑。Xiong Q等[23]利用QuilA、磷脂和膽固醇制成ISCOM-matrix作為佐劑與豬支原體肺炎抗原結合胸腔注射，可導致機體產生較強的免疫應答。ISCOM的加入可以減少抗原使用量，因此可作為亞單位疫苗的有效佐劑使用。

2.3 病毒樣顆粒（Viral-like particles，VLPs）

VLP是一種不含病毒核酸、由一種或多種病毒結構蛋白經自我裝配形成的、粒徑只有20～120 nm的顆粒狀復合物，具有高度有序的三維結構。VLPs具有較高的安全性和細胞攝取效率，還具有良好的溶解度、生物相容性以及靶向給藥和載藥能力[24]。能夠使疫苗抗原通過多聚化形成大小約100 nm的非可溶性顆粒，被巨噬細胞等APC攝取、處理和提呈，有效誘導體液與細胞免疫應答,作為佐劑具有很廣闊的應用前景。目前，研究者們已構建出多種病毒的VLPs，如口蹄疫VLPs、乙型肝炎病毒表面VLPs等，LIU等[25]經過對組裝的嵌合型VLPs進行免疫原性和保護效果的評價，發現嵌合型VLPs能引起明顯的體液和細胞免疫。GUO等[26]利用原核表達系統制備了VLPs免疫豚鼠、豬和牛，發現FMDV特異性中和抗體、T淋巴細胞和IFNγ被有效地誘導免疫動物。雖然已有多種病毒的VLPs在實驗室中成功制備，且具有良好的研發潛力，但要在商業化應用還需要進一步的研究。

2.4 納米顆粒（Nanoparticles，NPs）

NPs是指由粒徑在納米級（低于100/1000 nm）的超微粒子，可有效提高細胞、體液及黏膜免疫，比表面積大。NPs作為遞送類佐劑包括有機和無機納米顆粒兩種。林雅華[27]將磷酸鈣納米顆粒和水痘帶狀皰瘆病毒的糖蛋白E混合，肌肉注射Balb/c小鼠，結果表明添加了磷酸鈣納米顆粒的組能夠刺激機體產生更高水平的抗體滴度。潘雪[28]將腸道病毒71型病毒樣顆粒（EV71VLP）與乙二醇殼聚糖聯合注射小鼠，發現乙二醇殼聚糖佐劑組與單獨注射EV71VLP的實驗組相比，在誘導產生抗體速度方面具有更好的表現，且抗體滴度顯著升高。Mehrabi等[29]將IL-2的質粒DNA包裹于殼聚糖中與副傷寒病毒抗原結合免疫小鼠，結果表明殼聚糖包裹的組，機體的細胞免疫和體液免疫水平明顯升高。柴家前等[30]用納米蜂膠顆粒（NPP）免疫初生公雞，結果表明與對照組相比，機體T淋巴細胞比率和活性均顯著增加。綜上，納米顆粒有助于抗原在細胞內加工，與MHC分子特異性結合、運輸并遞呈給效應細胞，增強機體產生天然免疫應答，還能夠通過多種途徑到達APCs調節免疫應答，具有免疫佐劑活性，但目前仍存在安全性和局部產生不良反應等不足，而且不同納米材料的免疫策略及其理化性質的不同也成為納米佐劑研究的一大挑戰[31]。

3 復合系統類佐劑

隨著新型疫苗的快速發展，單獨使用一種佐劑有時難以誘導理想的免疫反應，不能滿足抗疫需要。復合系統類佐劑指將兩種或兩種以上的佐劑聯合應用，佐劑同時具備免疫調節分子和抗原遞送系統的特性與功能，使其在發揮各自優點的同時又互相促進，最大程度地發揮佐劑效應，進一步調節或增強免疫應答，提高免疫效果。陳振普等[32]將甘氨酸鋅和鋁佐劑復合與雞血清蛋白抗原聯合腹部皮下多點注射小鼠，與單獨鋁佐劑的對照組相比，復合佐劑可以誘導更高水平的抗體應答，增強雞血清蛋白誘導小鼠的體液免疫和細胞免疫應答反應。蘇菲等[33]將人參皂苷Rg1和重組大腸桿菌不耐熱腸毒素rLTB聯合作為佐劑，以卵清白蛋白（OVA）為抗原滴鼻免疫小鼠，發現與OVA單獨免疫組相比，Rg1-rLTB能夠顯著上調Th1、Th2和Th17型細胞因子的轉錄水平，提高血清和局部黏膜中的OVA特異性IgA和IgG抗體水平。因此，探究免疫佐劑的生物學特性及作用機制，有利于合理利用并開發新型疫苗佐劑。由此可見，多種佐劑復合發揮協同作用在新佐劑開發中具有相當大的潛力。

4 展望

現有佐劑除了明顯的疫苗增效作用外也有不足之處，在未來新型免疫佐劑研制中，研究者應同時考慮能夠增強抗原免疫效力、有效激活體液與細胞免疫應答、穩定性良好、安全性高、便于生產和使用等方面。隨著疫苗佐劑的不斷研究和探索，尤其對于那些免疫原性差、細胞環境易降解的新型疫苗來說，具有免疫增強和抗原遞送雙重作用的復合佐劑是將來研究的一大趨勢。因此，全面了解各個佐劑的機制和功能及其對免疫系統的影響，對推動新型高效佐劑的研發及臨床轉化應用具有重要意義。