菌群多樣性與巴雷特食管患者病理特征的相關性分析

克拉熱·阿合買提 赫曉磊 哈麗達·夏爾甫哈孜 張志強 高鴻亮

新疆醫科大學第一附屬醫院消化二科，新疆烏魯木齊 830054

Barrett 食管（Barrett’s esophagus，BE）以食管腸化生為主要組織學特征，目前BE 確切的發病率尚未完全明確，據估計其發病率為每年0.2%～2.0%，有1%～2%行上消化內窺鏡檢查的患者為BE，而有15%的BE 患者可出現胃-食管反流病癥狀[1-2]。BE 是食管癌前病變，可能進展為食管腺癌，每年每300 例BE 患者中有1 例進展為食管腺癌，而食管腺癌預后不良，大多數患者存活時間不超過5 年[3-4]。目前，胃腸道微生物群已被證明在胃腸道疾病、腸外疾病及各種癌癥中起著至關重要的作用[5-6]。最新研究顯示[7-10]，胃腸道腫瘤的發生和發展與微生物群通過DNA 損傷、癌基因信號途徑的激活、腫瘤誘導代謝物的產生和免疫反應的抑制有關。目前國內針對BE 與食管微生物的相關研究較少，故本研究基于此對BE 患者病理特征與菌群多樣性相關性進行分析。現將研究結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2016 年1 月—2019 年12 月于新疆醫科大學第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）消化科診治的141 例BE 患者納入研究，設為BE 組，并納入138 名同期常規體檢人群作為對照組。診斷標準符合《中國巴雷特食管及其早期腺癌篩查與診治共識（2017 年，萬寧）》[11]中BE 的診斷。納入標準：①經胃鏡下組織病理學檢查符合BE 診斷；②年齡≥18 歲；③臨床資料完整。排除標準：①近3 個月口服質子泵抑制劑治療＞5 d，近1 個月內使用抗生素、胃腸動力藥物及益生菌；②合并幽門螺旋桿菌感染、幽門梗阻及十二指腸梗阻者等；③近1 年行消化道手術等；④合并胃腸道惡性腫瘤；⑤合并嚴重心、腦、腎等臟器功能衰竭，不能配合病理檢查；⑥妊娠期婦女；⑦合并嚴重感染、自身免疫性疾病；⑧合并嚴重精神功能異常，不能配合。本研究通過我院醫學倫理委員會審核并批準，所有患者均對本研究知情，并簽署知情同意。

1.2 方法

所有患者均由經驗豐富的內鏡室醫師進行胃鏡檢查，鏡下留取食管末段活檢黏膜樣品，置于-80℃環境下備用以進行菌群分析，患者病理檢查結果由2 名工作經驗在10 年以上的病理科醫師共同報告。比較BE 患者與對照組患者食道菌群差異，并根據病理檢查結果將患者分為賁門腺型（53 例）、胃底腺型（59例）及特殊腸化生型（29 例），比較患者年齡、性別及病變分化程度等一般資料。采用快速DNA 提取檢測試劑盒[天根生化科技（北京有限公司），KG203]對樣本菌群的總DNA 進行提取，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行16S rRNA 測序與菌群鑒定；采用Uparse 軟件根據97%序列相似性對所獲得的原始序列進行可操作單元（operational taxonomic units，OTU）聚類、獲取分類信息；采用線性判別耦合效應分析（linear discriminant analysis coupled with effect sizemeasurements，LEfSe） 進一步探索兩組患者食管間差異顯著的菌屬，采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）評估每組物種豐度對差異效果影響的大小，其中LDA 評分＞2 分為菌屬差異有統計學意義；采用Mothur 軟件對不同分化程度患者食管菌落α 多樣性進行分析并比較。

1.3 觀察指標

1.3.1 臨床資料 比較患者年齡、性別、不典型增生程度及柱狀上皮長度。不典型增生程度[12]根據患者病理結果將不典型增生程度分為輕、中、重度，若病變累及上皮下部的l/3，為輕度；若累及超過上皮下部1/3～2/3 處，為中度；若累及上皮全層，為重度。柱狀上皮長度[13]根據化生柱狀上皮長度分為長節段及短節段，其中化生的柱狀上皮長度≥3 cm，累及食管全周者為常節段，化生柱狀上皮未累及食管全周，或雖累及全周但長度＜3 cm。

1.3.2 菌群多樣性 對患者菌群α 多樣性（主要為Chao1、Ace、Simpson 及Shannon 指數）進行分析并比較。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數據進行統計分析。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較比較采用SNK-q 檢驗。采用Spearman 模型對患者病變分化程度與菌群多樣性的相關性進行分析。以P ＜0.05 為差異統計學意義。

2 結果

2.1 菌群差異分析

LEfse 多級物種差異判別分析顯示，在屬水平上，BE 組與對照組均有4 個菌屬豐度更高；BE 組鏈球菌屬、梭桿菌屬、嗜血桿菌屬及葡萄球菌屬豐度低于對照組（P ＜0.05）；而BE 組彎曲桿菌屬、韋榮球菌屬、巴氏桿菌屬、普雷沃菌屬及奈瑟菌屬豐度高于對照組（P ＜0.05）。見圖1～2。

圖1 對照組與巴雷特食管組患者菌群分布層級樹圖

圖2 對照組與巴雷特食管組患者菌種差異分析（LDA 值分布柱狀圖）

2.2 不同分型患者一般資料比較

不同分型患者不典型增生程度比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；年齡、性別、柱狀上皮長度比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

2.3 不同程度不典型增生患者食道菌群多樣性比較

重度組Chao1、Ace 及Shannon 指數明顯高于輕度及中度組，且中度組高于輕度組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；而重度組Simpson 指數明顯低于輕度及中度組，且中度組低于輕度組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 巴雷特食管患者不典型增生程度與菌群多樣性的相關分析

相關分析顯示，Chao1、Ace 及Shannon 指數與患者不典型增生程度呈正相關（r=0.622、0.593、0.588，P ＜0.05），而Simpson 指數與患者不典型增生程度呈負相關（r=-0.582，P ＜0.01）。

表1 不同分型患者一般資料比較（例）

表2 不同程度不典型增生患者食道菌群多樣性比較（）

表2 不同程度不典型增生患者食道菌群多樣性比較（）

注：與輕度組比較，aP ＜0.05；與中度組比較，bP ＜0.05

3 討論

食管腺癌是目前常見的消化道疾病，5 年生存率低于20%[14]，研究認為食管腺癌起源于BE，而BE 及BE 進展為食管腺癌的公認危險因素為年齡、男性、肥胖及吸煙等[13,15-16]。目前關于食管失調、炎癥及BE 與食管腺癌發病機制間的關系尚不清楚，目前有相關研究認為BE 及食管腺癌與食管微生物群間具有一定聯系，既往研究認為食道微生物與口腔微生物群有關，但最新研究認為食道微生物群代表其自身的生態環境[17-20]。

胃腸道的微生物群約占體內代謝物的10%，常見定植菌可協助宿主消化、合成維生素，促進腸道免疫系統的發展，以防止病原體的入侵[21-22]。微生物-腸道間的平衡系由微生物、胃腸道屏障及黏膜免疫系統所共同維持的。若該內環境穩態失衡將會導致固有免疫及適應性免疫反應發生，從而誘發食管炎癥[23-24]。

本研究對BE 患者與正常人群食道菌群差異進行比較，結果顯示，與正常人群比較，BE 患者食道菌群發生變化，正常人群食道菌群中以革蘭陽性菌為主。本研究中對照組人群食管中鏈球菌屬、梭桿菌屬、嗜血桿菌屬及葡萄球菌屬豐度較高；而BE 患者食道則以革蘭陰性菌為主，其中彎曲桿菌屬、韋榮球菌屬、巴氏桿菌屬、普雷沃菌屬及奈瑟菌屬豐度較高。鏈球菌屬是正常食道中最主要的微生物屬，BE 患者食道中鏈球菌豐度則顯著下降，而BE 患者食道中豐度較高的彎曲桿菌屬可引能會引起食管黏膜慢性炎癥，誘導上皮化生，繼而可進展發生惡變[5,25]。而BE 患者食道中占優的革蘭陰性菌，其外模結構為脂多糖，可通過激活Toll 樣受體4、NF-κB 等通路上調促炎細胞因子白細胞介素（IL-6）、IL-8 及IL-1β 等的基因表達，通過參與不同方式的上皮細胞免疫反應，導致慢性炎癥，在胃-食管反流病，甚至腫瘤進展方面發揮作用[21,26]。此外，脂多糖表達升高還可通過增加食管下及體內括約肌中iNOS 蛋白及相關mRNA 的表達，從而使食管下括約肌壓力下降，增加胃食管反流及食管腺癌的發生風險。

此外，本研究通過對食道不同不典型增生程度與患者菌群多樣性進行比較結果顯示，不典型增生程度越高患者其食道內菌群多樣性越高。與正常食道菌群比較，BE 患者食道內常見定植菌鏈球菌豐度降低，而其他菌群增加，減少的鏈球菌可能系由其他菌群作為補償，而BE 患者食道中新增的菌群，可能系由口腔或胃內菌群移植而來，在BE 發生、發展及腫瘤惡變等過程中起到重要作用。菌群多樣性高的患者其BE分化程度越高，提示患者預后欠佳，具有進展成為食管腺癌的風險。

綜上，食道菌群變化可能與BE 的發生、發展及惡變相關，而食道菌群多樣性與BE 患者食道病變分化程度相關，食道菌群多樣性較高的患者其分化程度較高，進展惡變的風險相對較高，預后欠佳。故對患者食道菌群進行干預有可能成為預防及治療BE 的新靶點。但本研究存在一定不足，首先本研究納入樣本相對較少，分析因素相對單一，故使本研究結果具有一定局限性；食道菌群與患者吸煙、飲食習慣及質子泵抑制等藥物的應用相關，但本研究并未對上述因素與菌群間的關系進行進一步探究；本研究并未對BE食管患者食道變化的菌群具體致病機制進行分析，故應進一步行多中心、大樣本、多因素的研究對BE 食管患者病理特征與菌群多樣性間的關系進行分析。