攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌研究進展

余 艷，劉淑敏，杜 艷

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種重要的條件致病菌，在宿主免疫功能低下、菌群失調(diào)時，可引起呼吸道感染、泌尿生殖道感染、傷口感染、血流感染以及新生兒腦膜炎等[1]。碳青霉烯類藥物具有良好的細胞通透性及高度的酶穩(wěn)定性，是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）和頭孢菌素酶（AmpC酶）陰溝腸桿菌感染的主要藥物，隨著該類抗生素的廣泛應用，全球各地相繼出現(xiàn)碳青霉烯耐藥陰溝腸桿菌（CR-ECL）播散流行。CHINET耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2007年陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率＜1.0%，2017年，對亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率分別上升到6.9%、7.0%和8.2%，表明陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥趨勢十分嚴峻[2]。

產(chǎn)碳青霉烯酶是陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制，其中以新德里金屬β內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）最受關注。產(chǎn) NDM-1陰溝腸桿菌于 2007 年首次出現(xiàn)在印度，然后迅速播散到世界各地[3]。目前研究顯示在CR-ECL中，NDM-1檢出率最高，可能是CR-ECL的主要耐藥機制[2,4-6]。產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌常表現(xiàn)為多重耐藥，這種“超級細菌”的播散流行，是對臨床治療的嚴峻挑戰(zhàn)和對公共健康的重大威脅。

1 NDM-1概述

NDM-1共有270個氨基酸，分子量約28 kDa，氨基酸序列與其他已知的金屬β內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBL）相比，一致性不足33%[7]，其活性位點含有兩個鋅離子，NDM-1與底物之間的相互作用通過鋅離子實現(xiàn)，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）能抑制其活性[8]。隨著環(huán)境壓力的變化，酶會發(fā)生突變以提高穩(wěn)定性和適應性，從而導致功能發(fā)生變化。目前已鑒定出24種NDM-1突變亞型，命名NDM-1～NDM-24[9]。與NDM-1相比，其他突變亞型通常在氨基酸序列不同位置發(fā)生1～5個氨基酸替換，以M154L替換最常見，值得注意的是，所有突變均未發(fā)生在活性位點內(nèi)。已經(jīng)在陰溝腸桿菌中檢測到的突變亞型有NDM-4、5、7、22[6,9-10]。研究表明僅在鋅缺乏的條件下檢測到部分突變亞型的耐藥性增加，而且NDM-1正在進化以提高鋅親和力和鋅活性，從而應對感染部位有限的鋅濃度，表明鋅缺乏可能是驅(qū)動NDM-1進化的關鍵因素[10]。產(chǎn)NDM-1菌株給臨床治療和公共健康帶來極大威脅,原因主要有以下幾點：①在這些細菌中檢測到的大多數(shù)攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒是可轉(zhuǎn)移的并且能夠進行廣泛重組，表明其水平傳播的能力較強；②缺乏針對NDM-1的常規(guī)標準化表型檢測方法；③無癥狀攜帶者的患病率可能很高；④缺乏有效的抗生素來治療多重耐藥的產(chǎn)NDM-1細菌，最終導致感染患者出現(xiàn)高死亡率[8-9,11]。

2 流行現(xiàn)狀

2.1 國外流行現(xiàn)狀

NDM-1于2008年在印度1株肺炎克雷伯菌中首次被報道，Castanheira等[3]通過回顧性調(diào)查證實早在2007年印度就已經(jīng)出現(xiàn)了產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌，并且很多產(chǎn)NDM-1菌株都來自社區(qū)獲得性感染患者，表明blaNDM-1基因可能在環(huán)境中廣泛存在，但目前對其在社區(qū)傳播機制仍不清楚。2009年，Kumarasamy等[12]研究表明產(chǎn)NDM-1菌株在巴基斯坦、孟加拉國和英國廣泛存在，其中一半以上的感染患者至少在一年內(nèi)有印度醫(yī)療旅行史，推測產(chǎn)NDM-1菌株的傳播與印度旅行史密切相關。2013年，土耳其、尼泊爾、墨西哥、新加坡、英國等多國報道了此類細菌的醫(yī)院感染暴發(fā)，但具體流行起源尚不清楚[13-15]。美國退伍軍人健康管理局的一項研究顯示，在2014—2015年CR-ECL菌株的檢出率出現(xiàn)明顯增高[16]。抗菌藥物耐藥性趨勢監(jiān)測(SMART)結(jié)果顯示，全球55個國家/地區(qū)103 960株腸桿菌科細菌中，NDM-1在CR-ECL中的檢出率占比達到了36.36%，是最常見的碳青霉烯酶[17]。另一項跨國研究表明在產(chǎn)MBL菌株中，NDM-1所占比例最高達到了44.2%，MBL陽性菌株中陰溝腸桿菌排名第二，僅次于肺炎克雷伯菌，表明產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌分布廣、檢出率高[18]。目前多項研究顯示產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌的傳播可能與食物、水、空氣污染有關，這可能是導致該菌在全球迅速傳播的原因之一[8-9]。

2.2 國內(nèi)流行現(xiàn)狀

在中國，重慶醫(yī)科大學于2012年首次分離出產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌[19]，此后多次報道CR-ECL在碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）中分布最廣、耐藥率最高，NDM-1是當?shù)谻R-ECL中最常見的碳青霉烯酶，占比達61%，出現(xiàn)產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌暴發(fā)流行[20-21]。2015年，河南報道了多所醫(yī)院分離的CR-ECL菌株中NDM-1檢出率高達72%[4]，類似的報道還出現(xiàn)在寧夏、云南、大連和青島等地[22-23]。除了這些散發(fā)報道，Jin等[5]收集了中國11個城市臨床分離的CR-ECL菌株，其中90%菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，NDM-1占68%，并發(fā)生了深圳、東莞的小規(guī)模暴發(fā)流行。同時，中國一項大規(guī)模研究顯示在CR-ECL中檢測到的NDM-1從2013年25%增加到2016年的53%，占碳青霉烯酶的主要地位，并且產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌已經(jīng)在全國各地廣泛播散流行，以華中、華南、華東以及西南地區(qū)為主[6]，這與王盛書[24]的報道一致。

綜上所述，產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌已經(jīng)在全球各地播散流行，形成總體散發(fā)，局部高流行的趨勢，并且產(chǎn)NDM-1是CR-ECL的主要耐藥機制。值得注意的是，由于產(chǎn)NDM-1細菌耐藥性強、感染者臨床癥狀不一、各實驗室檢測能力不同以及全球廣泛傳播等因素再加上目前大部分研究是通過回顧性篩查留存標本獲得陽性菌株，也有少部分通過個案報道或暴發(fā)疫情檢出陽性菌，本文所涉及的可能只是產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌實際流行情況的冰山一角，其實際分布范圍可能更廣，引起的公共衛(wèi)生問題可能更加復雜。

3 耐藥現(xiàn)狀與傳播機制

3.1 耐藥現(xiàn)狀

產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌通常表現(xiàn)為多重耐藥或泛耐藥，其耐藥機制十分復雜。由于染色體編碼的AmpC酶，陰溝腸桿菌對氨芐西林，阿莫西林-克拉維酸，頭霉素以及第一、第二代頭孢菌素具有內(nèi)在抗性。NDM-1不能水解氨曲南，但產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌常攜帶ESBL耐藥基因，會使菌株對氨曲南也耐藥，再加上氨基糖苷類、喹諾酮類等多種耐藥基因的合并表達，細菌膜孔蛋白缺失以及外排泵高表達等多種耐藥機制并存，使其成為一種很難治療的超級細菌[2,5-6,21]。研究表明部分菌株能同時攜帶兩種或兩種以上碳青霉烯酶基因，比如共表達blaNDM-1和blaKPC-2，blaNDM-1和blaIMP-1等，兩種基因共存時要比blaNDM-1基因單獨存在時耐藥性更強[2,25]。多黏菌素和替加環(huán)素是目前治療此類細菌感染的主流選擇，大部分菌株對其敏感率較高，但隨著該類抗菌藥物的大量應用，多黏菌素耐藥基因（mcr）的出現(xiàn)使耐藥形勢更加嚴峻，目前已經(jīng)報道了同時攜帶blaNDM-1和mcr-1、blaNDM-1和mcr-4的陰溝腸桿菌[26]。同時也出現(xiàn)了對替加環(huán)素耐藥的菌株[27]，這些耐藥菌株的出現(xiàn)可能使得臨床治療陷入無藥可用的境地，隨之而來更大的挑戰(zhàn)就是如何控制耐藥菌的傳播。

3.2 耐藥傳播機制

耐藥菌不僅可以通過醫(yī)療器械、密切接觸等途徑在患者之間進行傳播，也可以通過一些移動遺傳元件（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等）進行耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，以及blaNDM-1基因的遺傳特征、攜帶blaNDM-1基因菌株的克隆背景等都可能導致耐藥性的廣泛播散。

3.2.1 質(zhì)粒（plasmid） 這是獨立于細菌染色體外能自我復制的環(huán)狀DNA分子，可攜帶耐藥基因加速細菌耐藥性的傳播。陰溝腸桿菌攜帶的blaNDM-1基因大多位于質(zhì)粒上，其中以 Inc X3、Inc FII 、IncA /C2、IncFIA等幾種類型質(zhì)粒最常見，blaNDM-1基因通過各種不同類型質(zhì)粒進行水平轉(zhuǎn)移傳播，并且某些型別的質(zhì)粒能在多種細菌中定植生存，從而大大加快了耐藥基因在同一菌種內(nèi)和不同菌種間傳播的速度[9,21]。

3.2.2 轉(zhuǎn)座子（transposon, Tn） Tn是基因組中可以從一個位點直接移動到另一個位點的一段DNA序列。中國第一株攜帶blaNDM-1基因鮑曼不動桿菌有完整的Tn125復合轉(zhuǎn)座子。賈曉炯[21]研究表明陰溝腸桿菌中blaNDM-1基因存在一段高度保守的序列，這部分序列不僅與中國分離的不動桿菌Tn125復合轉(zhuǎn)座子序列相似，也與澳大利亞分離的攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌的序列非常相似[28]，表明這部分序列可能是導致blaNDM-1基因在不同菌種和地區(qū)間迅速傳播的原因之一。

3.2.3 整合子（integron） 它是一種運動性分子，可以捕獲外源性基因來增強細菌適應環(huán)境的能力。一直以來，整合子被認為是介導抗生素耐藥性擴散、毒力以及致病性產(chǎn)生的重要移動元件，但目前沒有研究表明整合子與blaNDM-1基因傳播之間存在確切關系[29]。

3.2.4 遺傳特征blaNDM-1基因的周圍環(huán)境對耐藥性傳播非常重要，盡管blaNDM-1的確切來源尚不確定，但blaNDM-1的遺傳背景具有兩個共同特征，其上游都有插入序列ISAba125元件或片段，博來霉素抗性基因bleMBL則始終位于下游[9]，提示blaNDM-1基因周圍高度保守的序列可能與其在不同菌種、地區(qū)間廣泛傳播有關。

3.2.5 克隆播散 目前對陰溝腸桿菌的克隆傳播知之甚少，研究顯示攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌呈遺傳、克隆多樣性，攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌的廣泛傳播不僅僅局限于某一種或數(shù)種特殊的克隆型別、ST 分型，不同國家和地區(qū)間的差異較大[2,4-6,13-15]。因此，與肺炎克雷伯菌ST258、ST11與blaKPC-2廣泛傳播之間的緊密關聯(lián)不同，陰溝腸桿菌的ST類型與blaNDM-1的高流行率、廣泛地理分布關系不大[2,9]。

4 致病機制與毒力

除了耐藥，毒力也是細菌的重要致病因素,在感染中發(fā)揮重要作用。細菌感染宿主需要經(jīng)歷多個過程，首先是菌毛黏附系統(tǒng)吸附宿主細胞并發(fā)生定植[30]。細菌進入宿主細胞后分泌多種毒力因子以逃避免疫應答，陰溝腸桿菌的生物膜具有外周屏障、抵抗藥物的作用，使其能夠成功避免被清除，導致持續(xù)性、反復性感染，是其重要毒力因子[31]。細菌定植后鐵攝取系統(tǒng)可以幫助細菌吸收鐵，從而增強細菌侵襲性感染的能力[32]；體外細胞試驗表明陰溝腸桿菌的三型分泌系統(tǒng)能破壞吞噬細胞和上皮細胞，與細菌感染宿主后導致組織破壞、細菌擴散，引起全身性感染密切相關；研究顯示AcrAB-TolC外排系統(tǒng)不僅參與陰溝腸桿菌的耐藥性，還與細菌的適應性和毒力有關[33]。在感染過程中，陰溝腸桿菌能產(chǎn)生多種毒素介導細菌的致病性，如腸毒素、成孔細胞毒素、白細胞毒性細胞毒素、α溶血素、甘露糖敏感的血凝素等[34-36]，其致病機制復雜，涉及多種毒力因子，在疾病發(fā)展中的作用機制目前仍不清楚。

通常情況下，細菌在獲得耐藥基因后，由于適應性代價的原因，會導致毒力下降。但也有學者認為NDM-1主要與細菌耐藥性有關，不會影響毒力及致病性[37]。Brust等[31]對產(chǎn)NDM-1陰溝腸桿菌復合株進行毒力相關研究，結(jié)果表明在霍氏腸桿菌不同亞群中，blaNDM-1基因的缺失會影響生物膜的產(chǎn)生能力，但對大蠟螟幼蟲的毒力沒有統(tǒng)計學差異。趙金秋[38]通過體外生長能力和體內(nèi)毒力試驗證實blaNDM-1基因會使陰溝腸桿菌的繁殖能力及毒力增強。堯靜[39]通過構(gòu)建blaNDM-1基因敲除株與原始菌株進行比較，結(jié)果表明攜帶blaNDM-1基因會使陰溝腸桿菌體外生長能力增強，但對生長趨勢與生長速度無影響。

綜上所述，陰溝腸桿菌本身具有多種復雜的毒力因素，blaNDM-1基因的獲得可能會對陰溝腸桿菌的致病性和毒力產(chǎn)生一定影響，但目前相關研究較少，還需要大量研究進一步明確。

5 結(jié)語

盡管各衛(wèi)生保健機構(gòu)已經(jīng)作出了不懈努力，但攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌仍在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，此類細菌易于播散和多重耐藥的特性給公共健康帶來了極大威脅，對其進行流行病學調(diào)查，分析其耐藥機制、傳播途徑及致病機制，可為臨床治療與藥物研發(fā)提供幫助。除積極開發(fā)抗菌劑外，醫(yī)療機構(gòu)仍然需要加強耐藥監(jiān)測，嚴格控制醫(yī)院感染，避免攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌的暴發(fā)流行。