4D打印技術的醫學應用與展望

黨競醫，朱東澤，劉鑫成，孫立國，張煜珅，張昭，范宏斌

空軍軍醫大學附屬西京醫院骨科，西安 710032

3D打印是指在計算機輔助控制下，采用噴射、擠壓、熔融、光固化等方式制造出三維實體物品的過程。與傳統的減材成型和組裝加工模式不同，3D打印采用逐層堆積的增材制造方法，可精確實現復雜構件的“自由制造”，自20世紀80年代首次提出后便受到了廣泛關注并得到了迅速發展，為制造業帶來了革命性的變化[1]。然而，3D打印產品與傳統機加工產品的幾何結構都不會隨時間發生形變，無法充分模擬人體組織的動態演變[2]。鑒于此，為了充分模擬人體組織的動態愈合和再生過程，研究人員提出4D打印的概念，有望為其靜態局限性提供可能的解決方案，即將“智能材料”通過3D打印技術制備成初次結構產品，初次結構可按照預先設計的形狀在特定條件刺激下發生折疊、彎曲、膨脹或收縮，并形成最終結構。

1 4D打印概況

近年來新興起的智能材料逐漸應用于3D打印，給3D打印技術注入了新的活力。由于智能材料可感知內外部相關刺激并進行適度響應，可在時間軸上產生形變，突破了原有的靜態模式，滿足了人們對動態結構的需求，故而4D打印是在原有增材制造基礎上的進一步發展，即4D打印是在3D打印的基礎上增加“時間”這一維度。2013年麻省理工學院的Tibbits[3]在美國TED大會上向與會者首次展示了4D打印技術：他將一根由3D打印制造出的多串繩狀PVC復合材料管置于水中，在“水刺激”的作用下復合管發生形變，由繩狀緩緩地形成“MIT”字樣。由此，4D打印進入了人們的視野，其前瞻性和顛覆性的理念迅速吸引了大量研究者。

2 智能材料及其刺激因素

智能材料及其相應的刺激因素是4D打印的關鍵。近年來，隨著新型智能材料及其刺激機制的研究進展，響應體內外環境的4D打印技術在醫學領域的應用日益受到關注。

溫敏性形狀記憶材料是4D打印的經典材料。Miao等[4]以大豆油環氧化丙烯酸酯為材料打印出支持人骨髓間充質干細胞生長的溫敏性形狀記憶支架，平展的樣品于37 ℃下預彎曲成U形，隨后降溫至-18 ℃，使其進入臨時固定狀態；最后將樣品重新放置于37 ℃時，樣品可在1 min內完全恢復初始形態，表明該樣品不僅具有良好的生物相容性，且可顯著提高干細胞的附著和增殖能力。用于治療支氣管軟化癥的打印支架已成功應用于臨床。Zarek等[5]以甲基丙烯酸酯化聚己內酯為材料，打印出一種遇熱可產生形變的形狀記憶氣管支架。該支架隨著局部溫度的升高而擴張，并能很好地貼合人體缺陷的氣管。另外，體內微環境的pH值改變也可誘發智能材料產生形變。癌變或炎癥部位的酸化、胃腸道pH值的差異使pH響應材料用于抗癌藥物的可控釋放成為可能。Ramos等[6]證實了膠原蛋白和角蛋白的pH響應性，前者在中性pH范圍內溶脹度最小，而在弱酸性環境下溶脹度最大；后者在酸性環境下收縮成無序、塌陷的網狀結構，而在堿性環境下發生溶脹。天然蛋白質的這種pH響應性已被用于研究藥物如阿霉素[7-8]、抗生素[9]的智能釋放，可用于治療腫瘤及預防感染。酶也是一種常見的刺激因素，采用酶響應材料為載體，可實現藥物的精準投遞。Hu等[10]以腫瘤侵襲時高表達的基質金屬蛋白酶作為觸發因子，利用載藥水凝膠的酶降解作用，開發了自組裝水凝膠載體系統。該系統可通過控制藥物在體內按需輸送，進而調節與癌癥相關的各種細胞行為。另外，將細胞作為材料進行打印是生物制造的革命性突破。Tang等[11]將細胞打印成環形結構，利用細胞的自裝配特性，形成環狀血管移植物，證實了細胞打印用于血管化組織工程的可行性。

總之，合適的智能材料是4D打印的首要條件；作為觸發因子，刺激因素是實現智能材料形變的關鍵一環。智能材料與刺激因素相互作用是準確控制形變過程的必要因素。

3 4D打印與醫學應用

3.1 藥物遞送 靶向載藥系統由藥物及載體構成，可定向按需輸送藥物。載體是一種可結合到特定部位并能在刺激條件下釋放藥物的智能材料。Ghosh等[12]以不同溶脹比的聚合物水凝膠為材料，制備出基于自折疊的口服給藥裝置。該裝置由背襯層、可折疊雙層和藥物包埋的粘結層組成。其中，可折疊雙層由聚甲基丙烯酸交聯形成的pH敏感層和聚甲基丙烯酸羥乙酯形成的非溶脹層組成，前者與液體接觸可發生折疊，顯著促進黏液黏附，從而延長藥物在靶區停留的時間；后者作為擴散屏障，可減少藥物在腸道中的泄露。目前該微型裝置已成功應用于動物實驗[12]。光敏材料的形變可被光刺激精確控制。Gupta等[13]利用光敏材料打印出一種用于腫瘤治療的核-殼結構膠囊，藥物可裝載于核區，具有納米表征的等離子棒(AuNRs)裝載于殼區。通過特定波長的激光照射可使AuNRs溫度升高，間接對核區產生局部破壞，膠囊發生選擇性斷裂，藥物可選擇性釋放。此外，Zhang等[14]將Fe3O4納米顆粒與聚乙二醇(PEG)組合形成磁響應材料，用于控制多柔比星的釋放。Trenfield等[15]打印出一種基于琥珀酸的聚合物，可用于藥物撲熱息痛的遞送。

關于藥物遞送的研究已取得了巨大進展，與傳統給藥方式相比，智能載藥體系能夠靶向釋放藥物，從而減少藥物的毒副作用。目前的瓶頸問題是許多體內環境的變化指標(如血脂、血壓等)尚未找到相對應的智能材料。因此，4D打印智能材料在藥物遞送中的研究有待進一步深入開展。

3.2 生物支架 目前組織工程已涉及現代臨床醫學的多個方面。支架是組織工程的重要組成部分，智能材料的4D打印為生物支架的設計和應用開辟了新的路徑。Jamal等[16]以不同分子量的PEG為材料制備出雙層水凝膠支架并對細胞進行封裝，利用不同分子量的PEG層在水中膨脹比的差異實現支架的自動折疊。利用該特性，細胞負載支架可自動彎曲成不同半徑的圓柱體。經試驗，接種于該支架上的細胞8周后存活率高達90%。Senatov等[17]以聚乳酸(PLA)和羥基磷灰石(HA)為材料，打印出一種具有形狀記憶功能的多孔骨支架，對其熱學性能、力學性能、形狀記憶效應進行分析發現，該支架的形狀記憶恢復率高達98%，可作為自體植入物用于修復較小的骨缺損。另外，考慮到人體結構的納米特點，Zhu等[18]以石墨烯納米薄片為材料打印了神經支架模型，石墨烯可從近紅外照射中吸收光子，引發支架的自我變形并調節神經干細胞的生物學行為。

智能材料4D打印支架仍面臨諸多挑戰：(1)打印支架形變的有限性使其無法充分模擬人體微環境的動態演變過程；(2)支架置入引起的宿主炎癥反應可影響工程組織的構建且直接干擾種子細胞的主要生物學功能。

3.3 組織自愈 自愈是生物體內普遍存在的現象[19]。為模擬天然生物材料的自愈特性，近年來研發出了多種能夠修復內外部損傷的自愈性聚合物。Lai等[20]報道了一種在體溫作用下可發生形變的自愈聚合物，并設計了具有永久共價交聯和豐富弱氫鍵的聚合物網，共價交聯用于保持原有形狀，弱氫鍵用于產生臨時形狀。采用這種方法制備的聚合物薄膜在37 ℃(體溫觸發)下可從黏性狀態轉變為彈性狀態，且具有優異的力學性能和高效的室溫下自愈能力。室溫下將樣品切割成完全分離的兩半，隨后將分離的斷裂面重新接觸，材料斷端于25 ℃下發生愈合并可拉伸到原始長度的200%，移除外力后，由于其形狀記憶特性，樣品以較小的殘余應力恢復到初始長度。此外，功能凝膠與人體軟組織的結構功能相似，其固有的損傷后自我修復特性充分地展現了其潛在的應用價值。Dong等[21]基于殼聚糖-苯胺四聚體(CS-AT)與聚乙二醇之間的亞胺鍵合成了導電自愈性水凝膠。該水凝膠的電導率范圍與心臟組織相近，提示其在心臟修復中具有潛在的應用價值。CS-AT的氨基基團帶有正電荷，具有強大的抗菌能力(尤以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為著)。上述特性表明水凝膠具有強大的損傷修復能力。然而，水凝膠迅速降解的特性給打印體的完整性帶來了挑戰，如何延緩其降解速率有待進一步研究。3.4 器官打印 將細胞納入4D打印中，人們創造了更具仿生行為的直接生物打印技術。該技術通過控制不同種類細胞及細胞外基質的分布，構造出與人體高度相似的仿生組織。目前，細胞4D打印技術主要用于模擬制造可供臨床移植的組織和器官。Park等[22]使用4D打印技術制備了人工內分泌胰腺(BEAP)，由一系列經熱刺激而發生自組裝的多面體膠囊組成。4D打印技術可將胰腺β細胞封裝于多面體膠囊內，通過精確控制膠囊孔徑來控制膠囊內外擴散的分子類型。經測定，BEAP能夠釋放胰島素，且釋放量可通過患者的血糖水平而智能調節。與傳統組織工程中將細胞接種于可降解支架相比，該技術克服了細胞難于長入支架深部空間的問題，且構建了有生物活性的材料體系。

盡管細胞打印技術在組織器官重建方面的可行性得到了驗證，但由于人體組織器官的復雜性和精確性，該技術仍需克服許多問題：(1)組織器官功能的模擬對細胞的排列方式提出了更高的要求，4D打印空間分辨率有限，尚無法達到對單個細胞的精準控制；(2)智能材料的生物相容性有待進一步提高，細胞4D打印器官移植到人體面臨著巨大的挑戰。

3.5 人工血管 血管是維持組織器官功能的主要通道，通過提供營養、輸送氧氣、清除廢物來支持全身細胞功能。脈管系統的打印是構建復雜組織器官的重要基礎，一般認為，質量擴散僅能對100～200 μm范圍內的組織提供有效支持[23]，在沒有血管運輸營養物質的條件下，組織器官將無法發揮其特有功能，因此組織器官的血管化是一個迫切需要解決的重要問題。隨著科學技術的不斷進步，4D血管打印為解決這一挑戰提供了新方法。Moysidou等[24]將混合于水凝膠中的細胞球體打印成管狀血管移植物，管狀移植物內的活細胞通過不同的信號分子產生相互聯系，并調整細胞球體在基質中的位置。由于細胞的自黏附特性，離散的細胞球體緊密排列呈環狀結構，球形顆粒細胞相互融合組裝，在細胞因子的激活下打印細胞迅速發生血管化，進而構建組織工程化血管，形成連接一致的管狀移植物。值得注意的是，Moysidou等[24]僅構建了簡單的血管結構，而天然血管包括三層細胞組織(成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞)，因此，為了進一步構建完整的管壁結構，應同時考慮三種類型的細胞。在血管移植物的管腔中涂覆內皮細胞層是構建完整管壁的常用手段[25]。內皮細胞層具有減少血栓形成、防止堵塞的能力，且可確保血管移植物內的血液長期流動。Kolesky等[26]將人臍靜脈內皮細胞懸液涂覆到管狀血管移植物中以促進內皮化，48 h后，在打印移植血管的管腔中成功地形成了融合的人臍靜脈內皮細胞層。

近年來，4D打印在人工血管支架材料及構建模式等方面取得了重大突破，打印血管的生物性能逐漸得到優化。然而，人工血管目前仍存在許多不足，管壁的內皮化對打印技術及實驗技術提出了較高的要求，吻合口處的內膜增生及血栓形成一直以來也是制約其成為移植物的核心問題。在構建微血管方面，天然毛細血管和小靜脈的內徑低至8～20 μm，因此需要足夠的分辨率進行打印，4D打印的精確度不足與管腔通暢率較低使人工血管無法充分模擬人體血管。盡管生物打印技術在人工血管的制造方面表現出良好的生物相容性，但移植材料彈性不匹配、形變限制等問題仍是影響管腔通暢及移植血管長期有效的關鍵所在。

4 總結與展望

4D打印技術是一項革命性的實用工具，可使智能材料在獨特的仿生學基礎上實現復雜構件的自由形變，并強調在設計生物醫學設備時考慮人體動態的組織愈合和再生過程[27]。然而，4D打印是在材料學、生物學、機械學和計算機學等學科基礎上發展起來的交叉融合技術，受到相關學科發展的影響與制約。

目前，4D打印技術存在的主要問題包括：(1)現有的智能材料僅可進行簡單的形變，而人體組織結構的形變過程常復雜多樣，如血管適應性收縮、胃腸蠕動、心臟搏動等，因此器官組織工程修復對支架形變的復雜度提出了更高的要求；(2)3D打印制造條件與智能材料性能的匹配需要進一步研究，目前尚缺乏復雜智能材料構件的有效制造方法；(3)多種智能材料在指定區域的精確沉積需要更高分辨率的打印設備，這是精確變形和對多種刺激反應的必要條件；(4)在以智能材料為支架的4D打印中，當打印支架發生變形后，其內的細胞活性降低甚至死亡，尤其是以pH值變化和紫外線為響應刺激時這一問題更為突出，因此如何提高4D支架上細胞的存活率是未來研究面臨的嚴峻問題[28]。

總之，4D打印技術為生物醫學打開了一扇探索新型組織工程技術的窗口，但目前尚處于起步階段，面臨著許多未知的挑戰。隨著對智能材料的不斷挖掘和響應機制的不斷明確，相信4D打印的應用前景必將非常廣闊。