影響ELISA試驗檢測結果的環節及試驗成功的關鍵

郭紅佳 , 普朝華

（1.新平縣動物疫病預防控制中心 653400；2.新平縣畜牧推廣站 653400）

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），酶聯免疫吸附測定，指將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。具有靈敏度高、特異性好、穩定性強、適合批量操作等特點，被廣泛應用于臨床醫學、動物疫病診斷、食品安全檢測等領域。

1 ELISA試驗操作環節

1.1 試劑。試劑盒的質量直接影響檢測結果的準確性，試劑盒質量不過關或者存儲不當，導致試劑中抗原抗體的活性降低、失活，酶結合物濃度過高或偏低都將影響試驗結果。

1.2 待檢樣品。常用的待檢樣品一般為血清（血漿），樣品采集中若出現溶血、細菌污染， 很可能造成樣品假陽性，影響檢測結果準確性。

1.3 儀器設備。 試驗前校準移液器，提前預熱酶標儀，檢查其能否正常工作。

1.4 操作

1.4.1 回溫: 試劑盒未回溫將影響檢測結果的準確性。試驗前需將試劑盒從冰箱取出回溫至25℃，使用前各試劑充分混勻。

1.4.2 樣品稀釋: 樣品的稀釋倍數、方法，試劑盒操作說明均有嚴格規定，未按試劑盒說明書要求對待檢血清進行稀釋，或稀釋液與血清混合不均勻，將影響試驗檢測果。

1.4.3 洗液配置: 洗滌是ELISA試驗中操作次數最多的步驟，也是非常重要的一步。未嚴格按說明準確配置洗液，導致洗液濃度過高或偏低，造成洗板效果不佳，影響檢測結果準確性。

1.4.4 加樣: 加樣太快，液體濺出或產生氣泡；未垂直加樣，液體留在孔壁；加樣次序未按說明書進行；加樣時間過長，板孔間反應進程不一致。

1.4.5 溫育: 溫育是ELISA試驗的一個重要環節，必須按照說明書規定的時間、溫度進行溫育，實踐中常采用的溫育溫度有室溫或37℃，通常抗原抗體在37℃經過規定的溫育時間產物的生成達到頂峰。封板溫育時若陽性標本蒸發，會出現“花板”現象。

1.4.6 洗板: 洗板在ELISA試驗中雖算不上一個反應步驟，但卻決定著試驗的成敗，洗板的目的是為了去除反應體系中未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。洗板不干凈易導致試驗結果假陽性，而過度洗滌又會使抗原抗體洗脫，影響試驗測定結果。

1.4.7 顯色: 顯色是ELISA反應的最后一步，底物顯色一般在室溫或37℃反應10～15min，顯色時間、顯色溫度均影響檢測結果的穩定性，需嚴格按操作規程，固定顯色時間和溫度。

1.4.8 讀數: 顯色結束后迅速加入終止液，TMB的終止液一般為疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉等酶抑制劑，加入終止液后反應體系由藍色變為黃色，應盡快在2min內通過酶標儀讀取OD值，隨著時間的推移吸光度值將逐漸下降，導致檢測結果讀數不準。

1.5其他影響因素: 試驗時實驗室的環境、溫度、濕度亦是影響試驗結果的因素。

2 ELISA試驗成功的關鍵

2.1 試劑盒質量沒問題。工作中挑選三證齊全、質量可靠的試劑盒，避免非操作因素引起的誤差。

2.2 不同批號試劑盒不能混用，最好用新日期的試劑。

2.3 規范采樣。樣品采集過程盡可能做到無菌操作，全血的采集及血清的分離避免出現嚴重溶血和雜菌污染。

2.4 樣品保存得當。當天檢測的樣品標本置于冰箱2℃～8℃保存；一星期內檢測的樣品于-20℃保存；超過一個月后才檢測的樣品超低溫（-70℃）下保存。

2.5 樣品成功復溫。一般將樣品于實驗前半小時取出放置室溫下自然解凍復溫，樣本避免劇烈震蕩、搖晃，確保有效物質沒有降解。

2.6 嚴格按說明規程規范操作，操作過程沒有出現失誤，樣本編號沒有混亂。

2.7 移液器、酶標儀定期檢查校驗，酶標儀參數設定準確。

3 總結

3.1 任何實驗方法都要通過專業技術人員的操作完成，因此，實驗室工作人員應強化質量意識，優化實驗方法，提高實驗操作水平。

3.2 合格的試劑、精準的儀器、優良的設備、嚴格的操作規程以及排除各個環節的干擾因素是保證檢測結果準確、可靠的前提。

3.3 檢驗人員必須具備良好的職業道德和認真負責的工作態度，充分認識檢測質量對于疫病診斷治療的重要性，以高度負責的態度對待每一份檢測標本，確保每一份樣品的檢測結果準確無誤。