中藥干預自噬治療缺血性腦卒中作用機制研究概述

張雪玉 蔡恩麗 褚 鑫 藏 瑞 李旭華 武煜明

云南中醫藥大學，云南 昆明 650000

腦卒中又稱腦中風或腦血管意外，是全球首要致死和致殘病因。該病有出血性和缺血性之分，其中缺血性腦卒中約占比85%[1]。臨床一般采用經靜脈重組組織纖溶酶原激活物 (rt-PA)溶栓治療或血管內介入診療，有效的治療藥物還沒有獲得臨床證實，依然處于空白狀態。自噬是當細胞面臨低氧、炎癥、營養限制等應激環境時，能根據胞內不同環境和壓力下細胞器的數量及完整性，降解異常蛋白和受損細胞器去除不利于細胞存活的因素，并將降解所產生的物質循環利用于細胞更新修復的一種生存機制。中藥通過多條信號轉導通路干預自噬并揭示了腦缺血損傷后細胞內損傷及修復的機制，目前研究最多的是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及凋亡等通路。本文就傳統中藥干預自噬防治缺血性腦卒中的主要作用機制，進行如下概述。

1 中藥干預自噬對缺血性腦卒中的主要治療作用

1.1 減輕血腦屏障破壞 血管再通是缺血腦組織生存所必需的，但氧合血液突然流入缺血腦組織可能會破壞已經受損的血管內皮，加劇血腦屏障的破壞和通透性，過量液體和血漿蛋白外滲并停聚于周圍腦細胞間隙，引起血管源性腦水腫和血細胞外滲。研究證實，適度自噬可減輕缺血再灌注(CIR)引起的血腦屏障破壞。陶紅苗等[2]發現，CIR組神經元損傷較重，自噬泡增多，而缺血后適應組的適應性調控可對自噬產生抑制作用，有效緩解神經元損傷程度。三化湯具有宣行氣血、通腑開結的作用，可抑制血管源性水腫，促進神功能恢復，使血腦屏障免受缺血再灌注損傷[3-4]。藁本內酯是當歸揮發油的有效成分，通過干擾細胞內鈣離子代謝，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，減輕神經功能損傷程度，改善腦水腫及血管通透性[5]。

1.2 減輕氧化應激 當腦缺血及缺血再灌注時，驟然恢復血流和供氧導致代謝紊亂及興奮性中毒，活性氧(ROS)的產生與細胞抗氧化劑防御的內源性清除能力失衡造成氧化應激(OS)反應，能促使神經元功能喪失。研究證實，中藥干預自噬途徑可以改善OS，減少細胞毒性物質的生成，降低腦組織損傷。朱麗娟等[6]在體外擬CIR模型，發現當歸揮發油可以提高抗氧化能力，促進自由基的清除，使細胞死亡率顯著降低。紅花注射液具有抗氧化活性，可以降低缺血腦組織血清中丙二醛(MDA)及提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，有效清除自由基進而達到抗氧化的作用[7]。復方制劑丹紅注射液對腦缺血缺氧損傷具有一定的保護作用，其保護作用可能與抑制胞內ROS水平及脂質過氧化反應，降低缺氧對細胞膜的損傷[8]。

1.3 減輕炎癥反應 OS發生后，ROS還會通過神經元，內皮細胞觸發基質金屬蛋白酶(MMPs)和其他蛋白酶的釋放，進而侵蝕內皮基底層，浸潤性白細胞又釋放多種促炎介質，損傷血腦屏障，引發神經炎癥反應。炎癥與自噬在缺血性腦損傷中相互影響，調節炎癥因子的表達水平，可以降低自噬性死亡。實驗發現，丹參酮ⅡA可以下調TNF-α和白細胞介素-6( IL-6) 等促炎癥細胞因子的表達，提示丹參酮ⅡA預處理可通過抑制炎癥減輕CIR損傷[9]。補陽還五湯通過下調患者血清中的IL-6、TNF-α等炎癥因子水平，抑制參與炎癥反應的 MMP-2及 MMP-8水平，減輕缺血損傷[10-11]。抑制大鼠腦組織的內皮素-1(ET-1)高度表達引起的局部炎癥反應可能是鎮肝熄風湯發揮對腦梗死的防治作用的主要分子機制[12]。三化湯通過減少缺血腦組織中的 IL-1β，ICAM-1的表達，減少白細胞浸潤數量，減緩炎癥反應，保護神經元細胞[3-4]。阿魏酸是當歸揮發油中的有效成分，其發揮腦保護作用可能與抑制NF-κB的活化，下調TNF-α，IL-6等促炎癥因子的表達，抑制炎癥反應有關[13]。

2 中藥干預自噬治療缺血性腦卒中的主要作用機制

2.1 干預mTOR 信號介導的自噬 在缺血、缺氧等應激條件下自噬可被激活，這主要與mTOR調控有關，mTOR包含m TORC1和mTORC2兩種復合體，其中m TORC1含特殊的mTOR調控相關蛋白，是主要調節靶點，起負向調控自噬的作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的催化結構域包含磷酸化位點，可調節mTOR 的活性。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)是 mTORC1和mTORC2 相互作用的連接點。張怡[14]證實黃芪甲苷通過介導 AMPK/DDiT4/mTOR 信號通路激活自噬抑制CIR損傷。汪光云[15]建立CIR模型，加入PI3K的抑制劑后發現，通竅活血湯能夠激活 PI3K/AKt/mTOR通路，抑制腦缺血損傷后的細胞自噬，繼而發揮神經保護的作用。李丹丹[16]發現，人參皂苷Rg1可能通過誘導大腦局灶性CIR模型自噬相關蛋白Beclin-1、LC3和mTOR的表達水平，激活自噬誘導神經元存活。沈浩[17]發現犀角地黃湯能促進Akt/mTOR信號通路，抑制細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化，減少LC3-I向LC3-II的轉化及P62蛋白降解，下調半暗帶皮層組織的自噬水平，發揮缺血后腦組織保護作用。

2.2 干預MAPK信號介導的自噬 MAPK由P38激酶(p38 MAPK)，ERK，c-Jun氨基末端激酶(JNK) 構成。MAPK信號通路介導了缺血性腦卒中自噬的分子過程，JNK和p38 MAPK正向調節自噬，ERK反之。p38 MAPK信號通路適度活化能促進神經元抗炎、抗凋亡等作用，提高神經元存活率。反之，過度誘導則會促進靶基因表達激活轉錄因子和胱冬蛋白酶等，加速神經元損傷。Wang[18]等發現，黃連解毒湯組抑制mTOR的活化，從而誘導自噬與調節MAPK信號通路有關，通過激活ERK、抑制 JNK和p38 MAPK信號介導保護性自噬。賈冬雪[19]發現葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用機制與葒草苷調控JNK/ERK通路，抑制自噬水平相關。預給藥腦缺血大鼠補陽還五湯后，Akt 蛋白和 p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯降低，其機制可能與激活MAPK/ERK信號通路，促進神經元細胞再生有關[10-11]。

2.3 干預自噬效應蛋白 自噬過程需要自噬相關基因(Atg)的參與，其中自噬特征蛋白 Beclin-1和自噬體膜上標志蛋白微管相關蛋白輕鏈3(LC3)及自噬底物募集蛋白P62是參與自噬的三個關鍵蛋白。黃亞光[20]發現竹節參總皂苷能改善腦缺血再灌注后大鼠的神經功能，顯著減小腦梗死體積，且通過電鏡發現自噬小體減少，同時Western Blot檢測發現竹節參總皂苷抑制LC3Ⅱ和提高P62的表達，推測竹節參總皂苷可能通過抑制自噬的過度激活，從而緩解腦缺血再灌注損傷的發展。Zheng等[21]發現銀杏總內酯可以抑制缺血再灌注引起的Bec-lin-1表達上調。另外，蘭新新等[22]在腦缺血再灌注損傷治療作用的基礎上，發現銀杏總內酯抑制大鼠缺血復灌24、72 h的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，誘導自噬底物 P62表達，推測銀杏總內酯通過抑制缺血引起的自噬水平過度升高，發揮神經保護作用。

2.4 干預凋亡相關蛋白 一些凋亡相關蛋白可通過調節自噬治療卒中，如半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2) 家族基因，Bcl-2 家族包括抑凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax。Caspase 是執行細胞凋亡程序并調節炎癥介質的一種半胱氨酸蛋白酶，尤以caspase-3在缺血介導的神經細胞凋亡早期最為關鍵。caspase和Bcl-2可以裂解自噬相關蛋白，抑制凋亡能加速自噬的啟動。鄒玲[23]發現龍蛭湯組腦組織中Bcl-2蛋白陽性細胞率均明顯升高，Caspase-3陽性細胞則明顯減少，推測龍蛭湯能減輕CIR大鼠神經元損傷可能與調控Bcl-2和Caspase-3的表達有關。還發現菟絲子黃酮[24]、銀杏內酯[25]、川芎嗪[26]及血府逐瘀湯[27]對腦缺血大鼠都具有神經保護作用，一定程度上可減少大鼠神經細胞凋亡，主要與抑制Bax /Bcl-2和Caspase-3凋亡途徑有關。

3 總結與展望

綜上所述，應用中藥干預自噬治療腦缺血在大量動物實驗研究中已證實。中藥類單體和復方主要通過調控mTOR、MAPK及凋亡等信號轉導通路干預自噬，并對腦缺血后腦保護(梗死面積與神經功能評分及血腦屏障完整性)，抗氧化及炎癥等并發癥，阻斷血管再通引發的級聯反應方面具有顯著神經保護作用。近期人們把研究目光聚焦于溶栓療法與中藥神經保護制劑聯用對抗缺血后腦組織神經保護研究方面，并發現預后優于單用rt-PA，對緩解溶栓后缺血再灌注損傷具有一定的啟示作用。另一方面由于中藥成分復雜，作用靶點難以明確，如何在保留中醫整體觀念前提下，尋找中藥治療腦缺血主要作用及干預機制，值得進一步探索。本課題組下一步將從體內和體外兩個角度對中藥干預缺血性腦卒中自噬的具體機制進行深入研究。