狂犬病治療方法及抗病毒藥物應用的研究進展

劉 茜，朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一種以侵害中樞神經系統(Central Nervous System，CNS)為特征的高致死性的人獸共患傳染病[1]。目前狂犬病已經在150多個國家被發現，并且每年約有4～7萬人死亡。在99%以上的病例中，RABV都是通過家犬傳播到人類身上[2]。狂犬病臨床癥狀主要表現為兩種：第1種為狂躁型，表現為過度活躍興奮，并伴有恐水、唾液分泌較多、吞咽困難以及心律不齊等癥狀，最后以心跳呼吸停止而死亡；第2種為麻痹型，約占病例總數的30%，主要表現為患者的肌肉逐漸麻痹，隨后發展為昏迷、死亡。由于第2種類型經常被誤診，導致了狂犬病在流行病學上數據的不完整[3-5]。狂犬病在潛伏期沒有任何癥狀，一旦出現臨床癥狀，其病死率幾乎100%，所以，在暴露前或暴露后注射狂犬病疫苗，狂犬病的發病率會大大降低，可以起到有效預防的效果。截止目前，仍然沒有有效藥物和療法治療狂犬病，因此本文對狂犬病治療相關研究進展進行綜述和展望。

1 狂犬病治療方法

1.1古老的狂犬病治療方法 歷史上關于狂犬病的記載經歷了幾個世紀，在此期間人類一直同狂犬病做斗爭。在公元前1世紀時期，羅馬的醫生塞利烏斯[6]就對狂犬病的發病過程進行了較詳細和精確的記錄。他通過觀察和試驗推測狂犬病的發病可能是由于瘋狗分泌唾液中的某些物質傳播到被咬傷口上導致的，所以他嘗試采用腐蝕瓶、火罐、灼燒和吮吸等方法處理瘋狗咬傷的傷口。希臘醫生狄奧斯科里迪斯[7-8]嘗試過截肢術來治療狂犬病。到了中世紀前后，一些西方國家的醫生開始通過凈化、輸液、放血療法及藥物來治療狂犬病[9]。在中國古代，最早記錄狂犬病的書籍來自于《左傳》，人們那時已經意識到瘋狗對人的危害極大，他們通過驅逐瘋狗來降低危害。在我國古代相關醫書的記載中，人們嘗試采用內服和外治的方法來治療狂犬病。值得一提的是，外治的方法是使用酒來清洗被瘋狗咬傷的傷口，這個方法在現代療法中仍然適用。晉朝的葛洪通過觀察狂犬病的發病過程，嘗試通過使用咬傷人的狗的腦組織敷在傷口處來阻止狂犬病的發作[10]。現代中國的民間醫生也有采用草藥或復方中草藥來治療狂犬病，比如采用白芷、天麻等植物外敷，之后使用防風、羌活和紫草等進行內服，盡管出現這樣的藥方，但是效果都無從考證[11]。在印度，一些農村醫生曾在瘋狗咬傷的傷口涂上紅辣椒來治療狂犬病[12]。

1.2密爾沃基療法 密爾沃基療法是2004年由美國的Wisconsin醫學院兒科醫院羅德尼副教授創建[13]。當時該兒科醫院接收了一名15歲患狂犬病的女孩，此女孩在入院前一個月左右時左手被蝙蝠咬傷，并且前期沒有進行暴露后預防(postexposure prophylaxis，PEP)處置，在術前檢測時發現該小女孩的血清和腦脊液中存在具有中和性的抗RABV抗體。隨后羅德尼醫生對小女孩采取以下的治療方案：首先以氯胺酮進行誘導昏迷，之后給予抗病毒藥物利巴韋林和金剛烷胺輔助治療，最后給予患者鎮靜劑咪達唑侖和防止腦痙攣的苯巴比妥鎮靜。通過該方法成功搶救了此女孩，后來這種治療方法被稱為密爾沃基療法[1]。盡管該小女孩成為此方法治療成功的第一個案例，但是直到目前為止，關于該小女孩存活的具體原因仍然不明。在隨后使用該方法治療的其他6名發病后幸存的患者中，所有人之前都曾接種過狂犬病疫苗，并在后續觀察過程中發現這6名幸存者都存在一些嚴重的后遺癥，甚至出現死亡[14]。自從使用密爾沃基療法以來，至少有26份類似治療方法失敗的報告，甚至可能還有更多治療失敗的案例沒有被報道。其中在該療法中提到的咪達唑侖、氯胺酮和利巴韋林等藥物后來都被證實具有免疫抑制等副作用[15-16]。所以，最新的在線臨床治療中已不建議使用密爾沃基療法。

1.3狂犬病被動免疫療法 被動免疫療法是指通過輸入外源免疫效應物質來治療疾病的一種療法[17]，目前在狂犬病的被動免疫療法中應用最廣的免疫效應物質是狂犬病免疫球蛋白(Rabies Immunoglobulin，RIG)。但由于RIG大多數來源于動物和人的血液，存在供應不足、成本較高、半衰期短、批次不同影響穩定性等缺點，人們逐漸將焦點放在了單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)上。近年來隨著重組單克隆抗體的不斷發展及其在腫瘤學領域的廣泛應用，單克隆抗體逐漸成為人們解決血液來源RIG局限性的可行且有前途的選擇[18]。單克隆抗體具有特異性高，適用于大規模生產并且可以避免血液傳播等優點，越來越成為抗病毒治療上的有效生物制劑[19]。目前已經有5種候選產品的狂犬病病毒的單克隆抗體進入臨床試驗階段。研發最先進的產品是Rabishield，它由印度PVT.LTD.血清研究所(SIIPL)生產，經過2期、3期臨床試驗評估，于2016年在印度獲得許可，并于2017年推出[20]。該產品是一個單一的人IgG型單抗，可以結合到RABV糖蛋白的構象表位來中和RABV。此單抗的潛在缺點在于它只含有一種單克隆抗體，無法中和在秘魯蝙蝠[21-23]中發現的一種罕見的RABV變種。所以，該產品的具體實用性還有待進一步的調查。另外還有Rabimabs和SYN023也作為兩種RABV的單克隆抗體進入到臨床試驗階段[23]。盡管狂犬病單克隆抗體具有醫療需求和公共衛生益處，但產品要獲得批準倫理上仍然充滿挑戰。

2 潛在抗狂犬病病毒藥物

狂犬病的治療仍然是一個世界難題，人們在不斷探索中發現了很多潛在抗RABV藥物和靶點[24-25]。與只能用作預防的疫苗相比，抗病毒藥物不僅可以用作治療，并且還具有易保存、易生產以及成本適中的優點。另外，狂犬病的治療性抗體成本高、不易保存以及審核程序復雜，所以對于RABV自身來說，找到抗RNA病毒藥物要比疫苗和治療性抗體更加簡便。

已知對RABV具有抑制活性的主要藥物有利巴韋林、金剛烷胺和干擾素IFN-α，也有其他文獻報道過的T-705、香豆素和PGG等藥物。

2.1利巴韋林 利巴韋林是一種嘌呤類似物和RNA誘變劑，它可以以相同的效率摻入胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的模板中來誘導突變[26]。利巴韋林是一種廣泛的抗病毒劑，目前用于治療人的HCV[27]、拉沙熱病毒[28]和呼吸道合胞病毒[29]感染。有研究表明利巴韋林具有抗RABV感染的體外活性[30-31]，但是在腦內注射利巴韋林后發現其對RABV街毒株感染的小鼠沒有功效。著名的密爾沃基療法中的抗病毒藥物就包括利巴韋林[1]，但是由于利巴韋林對于狂犬病患者的治療缺乏療效和存在不良反應，致使密爾沃基療法出現了失敗。所以，關于利巴韋林是否可以治療狂犬病，仍然需要更多的研究和探討。

2.2干擾素 干擾素尤其是I型干擾素(IFN-α/β)，是抵抗病毒感染的重要防御手段。在包括Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和細胞質視黃酸誘導基因I(Retinoic acid-induced gene I，RIG-I))識別病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)之后，它們幾乎在所有細胞中產生，并誘導激活級聯反應產生I型干擾素。RABV進入神經系統后會觸發先天性免疫應答，包括I型干擾素應答。最近的研究表明，這種應答會限制RABV在接種部位的肌肉中傳播，并減慢向脊髓的轉移從而延緩小鼠的死亡。目前有實驗證明用外源性干擾素治療可防止RABV在細胞培養物中復制，尤其是在感染之前或感染后進行治療[32]。用外源干擾素或干擾素誘導劑(poly I：C)進行治療，可以部分或完全抑制小鼠和恒河猴模型中的RABV感染[33]。當在病毒感染之前或之后大劑量使用這種化合物并盡可能靠近病毒接種部位時，療效更高。

2.3金剛烷胺 金剛烷胺是一種合成的抗病毒藥物，也是一種弱的非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)拮抗劑，它可以抑制病毒在細胞中的復制[34]。有兩項體外研究評估了金剛烷胺在RABV感染中的作用。其中之一是金剛烷胺可干擾CER細胞中RABV固定株(CVS-11)的復制，其劑量依賴性的抑制作用范圍從25 μg/mL抑制10%到250 μg/mL抑制99.9%[35]。當藥物與細胞預溫育后并在病毒感染前移出時，或在吸附過程中將金剛烷胺添加到病毒中時，金剛烷胺不會抑制病毒復制，這表明病毒的附著和滲透可能不受藥物的影響，因此金剛烷胺可能會阻礙病毒的脫殼[36]。

2.4T-705 目前在抑制RNA病毒復制的分子策略中經常將病毒酶(特別是聚合酶)作為抗病毒藥物的潛在靶標[37]。在這樣的條件下，T-705(favipiravir)作為一種新型的廣譜RNA聚合酶抑制劑被人們廣泛關注。其顯著優勢在于它并不干擾細胞中DNA和RNA的合成[38]。有體內和體外實驗證據表明這種藥物可以抗流感病毒[39]、沙粒病毒[40]等。而Banyard AC等團隊也評估了T-705藥物的抗RABV作用，發現該藥在體外實驗中可以有效減少病毒的復制，但是在體內實驗中該藥在RABV暴露前和暴露后治療中效果有限[41]。所以，關于T-705抗RABV的具體作用機制，應鼓勵研究人員去評估。

2.5香豆素 香豆素(coumarin，CM)是一類重要的含苯并α-吡喃酮結構的芳香氧雜環化合物，其主要存在于植物的根莖葉中，也可以存在于細菌、真菌的代謝物中。根據其官能團的不同，可以分為9種，分別命名為CM-1～9，這些化合物具有多種功能，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化以及抗病毒等特點。在抗病毒方面，香豆素對HIV、皰疹、肝炎等具有顯著的抗病毒作用，并且有些已經進入臨床試驗階段[42-44]。而徐夢嫻等人已經發現CM-3可以有效抑制RABV在宿主細胞內的復制，但不能直接滅活病毒，不能阻止RABV對宿主細胞的吸附。之后通過動物實驗證實CM-3可將感染RABV的小鼠的存活率由0提升到12.5%[45]。因此，關于香豆素化合物是否能成為治療狂犬病的潛在藥物還有待進一步研究。

2.61,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖(penta-O-galloyl-beta-D-glucose，PGG) PGG屬于水解鞣質多酚類化合物，廣泛存在各種草藥中，如鹽膚木屬、牡丹屬和芍藥屬。它具有多種生物學活性，包括抗癌、消炎、抗氧化作用，同時它還具有廣泛的抗病毒作用[46-47]，涂忠忠等人發現PGG 不僅可以直接滅活RABV、抑制病毒的吸附和侵入，而且可以在病毒感染后抑制病毒基因和蛋白的表達。其中體內實驗結果顯示 PGG 可緩解感染RABV小鼠的臨床癥狀，并且可降低 27.3%的死亡率[48]。未來需要更多的實驗數據來證實它的可靠性。

3 展 望

狂犬病的病死率幾乎100%的原因有4點。第一，從RABV傳播途徑可知它并不像其他病毒那樣通過自身強大的復制能力抵御機體的免疫系統或者通過攻擊免疫能力下降的宿主來繁殖，它主要是通過免疫豁免的神經系統進行傳播和復制，這樣不僅為該病毒傳播提供了充足的時間，并且也正好逃避了人免疫系統的攻擊，因此RABV的嗜神經特性是導致狂犬病致死的主要原因[49]。第二，RABV在感染機體后并不能引起足夠的天然免疫反應來反抗病毒，所以狂犬病在潛伏期缺乏明顯的癥狀，阻礙狂犬病早期診斷也成為狂犬病高度致死的原因之一[50]。第三，RABV可以被狂犬病毒抗體中和，但是有效的抗體無法通過血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)進入中樞神經系統，這也是狂犬病致死的一大原因[51]。第四，當前沒有有效的用于體內殺滅或抑制RABV的藥物。因此，本文也對未來狂犬病治療方面的研究進行展望。

3.1血腦屏障的突破 RABV抗體可在體外或病毒進入中樞神經系統前高效中和RABV[52]。然而，一旦病毒進入中樞神經系統，這些抗體就被限制通過具有免疫特權的血腦屏障，從而不能中和感染的病毒[53-54]。雖然從理論上講，這種抗體可以在腦內注射，但它絕對不是一種實用的治療方法，所以提高血腦屏障的通透性至關重要。已有報道稱RABV的弱毒株、細胞因子MCP-1等物質可以增強血腦屏障的通透性使免疫細胞進入中樞神經系統消滅病毒[55]。另外，有人在小鼠實驗中通過使用細胞因子MCP-1增強血腦屏障的通透性后，靜脈注射病毒中和抗體可以清除中樞神經系統的RABV，并且延長了感染RABV小鼠的生存時間[56]。此研究正好為狂犬病的臨床治療提供了基礎，例如可以采用提高血腦屏障通透性的藥物或弱毒株等打開血腦屏障，之后通過注射抗體或抗病毒藥物中和或殺滅病毒。

3.2神經或免疫細胞相關信號通路 有研究發現在感染RABV實驗小鼠的大腦中，神經細胞出現的細胞凋亡相較于免疫細胞并不明顯，這種差異是由于RABV通過將其自身基因表達維持在閾值水平以下來干擾促凋亡因子，從而保證了受感染神經元的存活[57]。另外，有研究發現RABV通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，其途徑包括線粒體膜電位的改變、細胞色素C的釋放，這些結果提示RABV在不同感染階段利用線粒體來調節細胞凋亡，從而為病毒復制和傳播提供條件[58]。所以未來在治療狂犬病方面，神經細胞中的線粒體相關信號通路的變化以及免疫細胞的凋亡相關問題可以是進一步研究的方向[59]，通過找到相關靶點來篩選特定藥物以達到治療的目的。

3.3狂犬病病毒G蛋白 有報道稱RABV誘導的免疫細胞凋亡依賴于糖蛋白的限制性表達，其中包括G蛋白羧基端PDZ域結合基序的4個氨基酸。G蛋白表達量越低，狂犬病的致病性越強，因此，未來以降低G蛋白的表達為策略尋找相關治療方法也可以作為治療狂犬病的一個重要手段[60]。

3.4治療性疫苗 在狂犬病治療方面也有一些其他的探索，例如狂犬病的治療性疫苗，傅振芳團隊利用無致病力的5型副流感病毒(PIV5)表達RABV的G蛋白，作為RABV感染的治療方法。結果發現，PIV5-G可以在RABV感染后的6 d之內保護小鼠。因此該PIV5-G可以用于預防和治療RABV感染的候選疫苗[61]。未來開展治療性疫苗與治療性抗體相結合的方法也是一種治療狂犬病的策略。

4 總 結

狂犬病當前仍然是沒有治愈方案的傳染病，人們嘗試通過不同方法去治療，但是療效甚微，而抗病毒療法是目前開發有效的人類狂犬病治療的重要組成部分。開發包括具有廣譜活性的T-705等抗病毒藥物，盡管會存在不同缺點，但是通過優化使用條件或者聯合使用對治療狂犬病仍然具有重大意義。最后，通過新的靶向方法，包括RABV的G蛋白的表達、線粒體介導的細胞凋亡、神經元的氧化損傷等都是未來可以研究探討的內容。隨著我們對RABV致病機制的進一步深入研究，將會發現更為有效的狂犬病治療方法。

利益沖突：無