弓形蟲弱毒疫苗的研究進展

張海生，馬元元，謝世臣，梁勤立，朱興全，王金磊

剛地弓形蟲簡稱弓形蟲，是一種專性細胞內寄生的機會性致病原蟲，可感染包括人在內的幾乎所有溫血動物；全世界約有30%的人感染，我國人群感染率約為5%～20%[1-2]。弓形蟲病給畜牧業造成嚴重經濟損失，使人類健康受到嚴重威脅。由于弓形蟲生活史復雜、宿主廣泛、發育時期多且各發育期抗原成分特異性顯著，致病、免疫機制復雜，至今無有效的抗弓形蟲病藥物和理想的防治方法。人類感染弓形蟲的主要途徑是通過食源性感染，如食用加工不熟的肉類和不干凈的果蔬等，弓形蟲包括不同基因型的蟲株，例如傳統的Ⅰ型(ToxoDB#10)、II型(ToxoDB#1)和III型(ToxoDB#2)蟲株[3-5]。由于弓形蟲廣泛的宿主范圍以及在動物和人群導致的高感染率，疫苗免疫是預防人和動物弓形蟲病的重要策略。雖然科研人員研究了針對弓形蟲的多種傳統疫苗，例如滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、核酸疫苗、重組蛋白疫苗等，但是各有其缺陷，對動物的免疫保護力不強。目前效果最好的是弱毒疫苗，例如自然或人為篩選的S48、T263、TS-4等，其中S48已制成弓形蟲Toxovax 疫苗[6-8]。用傳統基因編輯技術已構建多株弱毒蟲株，具有較好的免疫保護作用。通過CRISPR-Cas9在弓形蟲研究中的成功應用，已構建了多株具有良好免疫保護作用的弱毒疫苗。本文綜述弓形蟲弱毒疫苗的研究進展和發展前景，旨在為弓形蟲疫苗的后續研究提供參考。

1 弓形蟲傳統弱毒疫苗

TS-4蟲株是由弓形蟲RH株通過化學突變后獲得，該蟲株可有效防止組織包囊的形成，可部分預防先天性弓形蟲感染并提高急性感染的存活率[11]。TS-4蟲株雖在豬模型中以及在免疫力強的靈長類動物體內安全使用，可作為很有希望的疫苗株，但它的安全性有待進一步評價。

弓形蟲T263蟲株由自然突變而來，給貓接種T263蟲株速殖子后，當弓形蟲感染貓時，可成功阻止84%的貓排出卵囊[11-13]。但由于該蟲株不能完全阻止貓卵囊的排出，以及考慮到安全性問題，該疫苗株并未商業化[11-12]。

2 弓形蟲傳統基因編輯疫苗

弓形蟲傳統基因編輯疫苗是通過傳統基因編輯技術如鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術等構建弓形蟲基因敲除株，成為弱毒疫苗株，例如RHΔMIC1-3、PruΔOMPDC、RHΔCPS1-1等。RHΔMIC1-3是弓形蟲Ⅰ型RH株的MIC1和MIC3基因雙敲除后所構建的弱毒株，MIC1可形成弓形蟲粘附所需的結構域，該結構域可特異性結合乳糖；MIC3則形成表皮生長因子樣結構域和1個凝集素樣結構域[14-16]。弓形蟲的MIC1和MIC3這兩個基因同時敲除之后不僅影響弓形蟲的粘附和入侵，還影響弓形蟲的毒力[14]。如果單獨敲除MIC1或MIC3基因則對弓形蟲毒力只是微弱的減弱，當對MIC1和MIC3基因雙敲除時弓形蟲的毒力明顯降低[15]。RHΔMIC1-3在小鼠體內對先天性弓形蟲感染具有很強的保護作用，且可有效阻斷弓形蟲的垂直傳播，誘導小鼠產生有效免疫應答[15]。除小鼠外，RHΔMIC1-3還可使綿羊產生有效持久的免疫保護力，免疫接種懷孕綿羊時雖然具有輕微的發熱現象但是不具有感染性；用105個RHΔMIC1-3速殖子接種雌性綿羊可以有效防止綿羊流產，并且減少母羊所產羔羊組織包囊的數量[10]。有趣的是，RHΔMIC1-3接種貓后并不會在貓體內繁殖，它可使貓體內產生抗體，但該抗體并不能阻止野生株在貓體內的繁殖，這表示RHΔMIC1-3具有宿主特異性[16]。

尿嘧啶是弓形蟲繁殖和毒力形成所必需的，弓形蟲具有完整從頭合成尿嘧啶的途徑[17-18]。脫羧酶(OMPDC)和氨甲酰磷酸合成酶II(CPSII)是弓形蟲從頭合成尿嘧啶途徑中的關鍵調節酶，這兩種酶由OMPDC基因和CPS基因所決定[17-19]。敲除OMPDC基因或CPS基因均會形成尿嘧啶缺陷型蟲株。PruΔOMPDC是在弓形蟲II型Pru蟲株上敲除OMPDC基因所得到的毒力完全減弱的不可逆蟲株。OMPDC基因的敲除使蟲株繁殖能力喪失、毒力完全減弱、喪失形成包囊和慢性感染的能力[18]。PruΔOMPDC可有效誘導機體產生強烈的體液免疫應答，細胞因子CD8+的含量明顯急劇增加，接種小鼠后可預防弓形蟲I型和II型蟲株的急性感染，并可大幅度降低II蟲株感染后形成包囊的能力[19]。

RHΔCPS1-1蟲株也是由弓形蟲強毒株RH改造構建而成的，接種RHΔCPS1-1速殖子可誘導小鼠產生長期的保護性免疫力，能有效防止弓形蟲RH株的感染[20]。RHΔCPS1-1蟲株還可有效延長被弓形蟲慢性感染小鼠的存活時間，提高弓形蟲急性感染的小鼠的存活率，還可減少組織包囊的數量并阻止弓形蟲向腦內移行[21-22]。

3 CRISPR-Cas9基因編輯疫苗

2014年Shen B等人首次成功實現CRISPR-Cas9技術對弓形蟲的基因編輯操作[23]。CRISPR-Cas9系統可用于弓形蟲大規模、高通量和任意基因的基因編輯操作。相對于傳統基因編輯方法的局限性，它不僅成本低、操作簡單、更精確和更高效，有效地解決了弓形蟲基因操作復雜的問題，并且可快速構建基因缺失蟲株[24]。CRISPR-Cas9技術主要用于弓形蟲的生物學研究、抗弓形蟲藥物和疫苗的研發、弓形蟲基因的鑒定和篩選，尤其是CRISPR-Cas9可快速鑒定和敲除弓形蟲的毒力基因。目前，通過CRISPR-Cas9技術所構建的候選弱毒疫苗株主要有RHΔGRA17、PRUΔCDPK2、RHΔTKL1、RHΔNPT1、ME49ΔLHD、RHΔMORN1、ME49-ΔADSL等。

3.1RHΔGRA17弱毒株 RHΔGRA17弱毒株是弓形蟲RH蟲株的GRA17基因缺失的弱毒蟲株。GRA17基因是具有潛在免疫原性的毒力基因，它可以調控弓形蟲納蟲泡的穩定性并與營養攝取有關[25]。GRA17蛋白位于納蟲泡膜上，決定了其膜的通透性，若GRA17過表達則會加快弓形蟲的生長速度[26]。用5×104個RHΔGRA17速殖子免疫小鼠，可以對弓形蟲急性、慢性和先天性感染均產生顯著的保護作用[27]。RHΔGRA17引起小鼠體內強烈的Th1和Th2反應，在先天性感染中使仔鼠的成活率和體重都有顯著的提高[27]。

3.2PRUΔCDPK2 弱毒株CDPK2基因是弓形蟲鈣依賴性蛋白激酶家族的一員，CDPK2在調節支鏈淀粉的形成和降解中起著關鍵作用[28]。弓形蟲以支鏈淀粉的形式儲存能量，支鏈淀粉轉化所需酶的磷酸化是依賴于CDPK2，CDPK2的活性由Ca2+信號調節[28]，所以CDPK2將Ca2+信號與弓形蟲內支鏈淀粉的降解聯系了起來。若CDPK2被破壞，支鏈淀粉在弓形蟲體內會大量聚集[29]。此外CDPK2與弓形蟲緩殖子的形成有關，CDPK2基因的缺失可導致緩殖子期的超微結構改變和活性喪失[29]。PRUΔCDPK2免疫后小鼠主要產生的是Th1型免疫應答，可在高劑量的弓形蟲RH株攻擊下延長小鼠存活時間[29]。PRUΔCDPK2在小鼠體內可誘導強烈的免疫保護應答，是潛在的弓形蟲弱毒疫苗蟲株。

3.3RHΔTKL1弱毒株 RHΔTKL1是由弓形蟲RH株敲除TKL1基因所構建的。TKL1基因與弓形蟲的粘附作用和毒力有關，當TKL1基因被敲除后弓形蟲對小鼠的毒力就會喪失，所以TKL1是潛在的毒力基因[30]。使用1×106個弓形蟲RHΔTKL1速殖子接種小鼠，可對急性、慢性和先天性弓形蟲病具有顯著的保護作用，并且被RHΔTKL1免疫的小鼠死亡率和胎兒流產率均大幅度降低，所以弓形蟲RHΔTKL1是一種有前途的候選弱毒疫苗株[30]。

3.4RHΔNPT1弱毒株NPT1基因是弓形蟲假定轉運蛋白的成員，它在弓形蟲攝取陽離子氨基酸的過程中起著重要作用[31]。在弓形蟲RH株上敲除NPT1基因后構建RHΔNPT1菌株，用1×106個RHΔNPT1速殖子免疫小鼠后再用RH、PYS和Pru蟲株的速殖子和Pru蟲株的包囊通過不同的感染途徑攻擊感染小鼠，均100%存活[31]。RHΔNPT1弱毒株不僅能完全保護不同基因型弓形蟲株的急性感染，在慢性感染中還能提高小鼠的存活率，減少腦包囊的形成[31]，也是一種具有潛力的弓形蟲減毒活疫苗株。

3.5ME49Δldh弱毒株LDH1和LDH2均為弓形蟲乳酸脫氫酶基因，將這兩個基因敲除后的弓形蟲突變株為Δldh，Δldh速殖子在體外生長良好但在小鼠體內不能繁殖[32]。Δldh接種小鼠后可誘導機體產生強烈的細胞免疫應答，也引起部分的體液免疫應答，Δldh的毒力嚴重減弱，但其誘導的強烈免疫力在30 d內可對弓形蟲Ⅰ型毒株的攻擊產生有效的防護[32]，所以Δldh顯示了它作為候選弱毒疫苗的巨大潛力。

3.6RHΔMORN1弱毒株 通過CRISPR-Cas9技術還探究了MORN1和MORN2基因在弓形蟲I型RH株中的功能，MORN的全稱為Membrane Occupation and Recognition Nexus，中文可翻譯為膜占位和識別聯結小體，MORN1伴隨子代速殖子的產生[33]。研究證實MORN2基因的缺失不影響RH株在體外的生長速度，RHΔMORN1缺失株能夠長時間刺激機體產生免疫應答，有效保護小鼠抵抗急性、慢性以及先天性弓形蟲感染，可作為弓形蟲候選弱毒疫苗株[33]。

3.7ME49ΔADSL弱毒株ADSL基因是弓形蟲腺琥珀酸裂解酶基因，弓形蟲是嘌呤缺陷型生物，ADSL基因參與弓形蟲宿主嘌呤的相互轉化和補救合成[34]。在弓形蟲Ⅱ型ME49蟲株的基礎上對ADSL基因進行敲除，可以降低其速殖子生長速度，并且可以減弱其形成包囊的能力[34]。用100個ME49ΔADSL速殖子單次免疫小鼠可以對Ⅰ型RH株、Ⅱ型ME49株和Ⅲ型VEG株的攻擊產生有效的保護作用[34]，ME49ΔADSL弱毒株可明顯提高小鼠存活率和減少形成包囊的數量，在免疫后30 d或70 d再次用野生毒株對其進行攻擊感染，小鼠存活率均為100%[34]，所以該弱毒株可作為一種很有潛力的弓形蟲弱毒疫苗株進行深入研究。

4 展 望

綜上所述，弓形蟲的弱毒疫苗研究取得了重要進展，尤其是CRISPR-Cas9技術在弓形蟲中的應用，加快了弓形蟲弱毒疫苗株的構建及評價的速度。CRISPR-Cas9技術也有自身的缺陷，例如脫靶率較高，PAM序列限制等問題。通過敲除形成的弱毒疫苗株存在不能完全防止水平傳播和垂直傳播、不能100%阻止包囊的形成等缺陷；弱毒株對免疫功能缺陷者會不會產生反毒現象？這些弓形蟲基因敲除弱毒株目前只在小鼠模型上取得了較好的保護作用，在其他動物模型如貓及食品動物或者人類身上是否同樣適用？這一系列問題還有待進一步解決。

到目前為止，弓形蟲弱毒疫苗株只在小鼠上進行了毒力評價，還需要進一步在食品動物體內進行評價，尤其是豬、牛、羊等。除單基因敲除外，我們應該考慮構建多基因敲除株。在未來弓形蟲疫苗的研制中候選基因的選擇、免疫佐劑、免疫劑量、免疫途徑的優化等，這些都是弓形蟲疫苗研究中需要攻克的難關。弓形蟲病的最終防控是希望弓形蟲疫苗能在貓上成功應用，從而阻斷弓形蟲的傳播。相信隨著科學技術的不斷發展，最終將研發出安全有效且對人、貓和各種食品動物完全保護的弓形蟲疫苗，保護人類健康和促進養殖業的發展。

利益沖突：無