背根神經節在藥物神經毒性體外評價中的應用

王美婷，趙 琪，張藝哲，邢紅艷，汪溪潔

（中國醫藥工業研究總院，上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203）

藥物誘導的嚴重神經毒性是導致新藥研發失敗的原因之一。由于動物模型在藥物神經毒性評價和機制研究等方面存在諸多不足，如種屬和遺傳背景差異大、周期長和費用高，藥物神經毒性研究的模型逐漸從體內動物模型向體外細胞模型轉變［1］。背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）神經元接收機體的感覺信息并向脊髓傳遞，已作為體外細胞模型廣泛應用于藥物神經毒性研究。隨著細胞重編程和干細胞分化技術的發展，人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSC）分化和成纖維細胞重編程的DRG神經元在藥物神經毒性研究的應用也開始備受關注［2］。本文綜述不同來源的DRG神經元體外模型的特點，以及采用DRG神經元開展藥物神經毒性體外評價的最新進展。

1 背根神經節概述

DRG來源于神經嵴的前體細胞，屬于外周感覺神經節，其中的DRG神經元為假單極神經元，由多種感覺神經元亞型組成，具有將疼痛、溫度和壓力等感覺刺激信號向中樞神經系統傳遞的功能。根據形態和功能的不同，DRG神經元可分為傷害性神經元和非傷害性神經元［3］。

1.1 傷害性神經元

傷害性DRG神經元支配上皮和肌肉等組織，能對疼痛、瘙癢和溫度變化等刺激做出反應［4］。傷害性神經元直徑較小，多為無髓C纖維感覺神經元和薄髓Aδ纖維感覺神經元，表達原肌球蛋白相關激酶A（tropomyosin-related kinase A，TrkA），對神經生長因子具有高親和力，釋放谷氨酸作為主要的神經遞質，可進一步分為肽能神經元和非肽能神經元［5］。肽能神經元釋放P物質和降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等神經肽，而非肽能神經元則主要表達同工凝集素B4（isolectin B4），同工凝集素B4可特異性地與傳遞傷害性刺激信號的周圍感覺神經元相結合［6-7］。

1.2 非傷害性神經元

非傷害性DRG神經元主要分為本體感受和機械感受2種類型。本體感受型神經元由厚髓Aα和Aβ纖維組成，傳導速度很快，可感知肌收縮和肢體位置［8］，平衡感覺和運動，表達TrkC，可被神經營養因子3激活［9］。大部分投射到皮膚的表皮和真皮區域的非傷害性DRG神經元是機械感受型，其通過特有的感覺神經末梢傳導機械刺激信號［8］。機械感受型神經元由厚髓Aβ纖維組成，以表達TrkB為特征，對腦源性生長因子（brainderived growth factor）具有高度親和力，支配皮膚組織并傳遞皮膚的觸覺和振動刺激信號等非傷害性刺激信號［10］。

2 背根神經節體外模型來源

DRG神經元是感覺信息傳入的初級神經元，目前研究中所采用的DRG神經元可直接來源于嚙齒類動物、非嚙齒類動物和人，也可間接來源于成纖維細胞和人多能干細胞。

2.1 直接來源的背根神經節神經元

2.1.1 嚙齒類動物

嚙齒類動物DRG神經元來源廣泛，是研究基本的信號通路、神經網絡和疾病發生機制的重要工具［11］。然而嚙齒類動物與人類遺傳背景不同，其實驗數據外推至人的可靠性有限，因而探討嚙齒類動物DRG神經元與人類DRG神經元之間的差異和相似性尤為重要［12］。Rostock 等［13］觀察到，TrkB 和TrkC在人和小鼠的DRG神經元中的表達相似，而TrkA和瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在人和小鼠DRG神經元中的表達存在顯著差異。Li等［14］發現，約46%小鼠DRG神經元表達重多肽神經絲蛋白（neurofilament heavy polypeptide），而 97.3% 人DRG神經元表達［13］。與人DRG神經元相比，嚙齒類動物DRG神經元Nav1.8通道表現出更快的失活動力學、更小的電流以及更低的神經元放電頻率［15］。此外，人DRG神經元大多可同時表達CGRP和P2X3受體，而小鼠DRG神經元則只能表達單一受體［16］。因此，研究者采用嚙齒類動物模型研究這些指標時，應格外注意種屬差異對實驗結果產生的影響。

2.1.2 非嚙齒類動物

當前，犬、兔和猴等非嚙齒類動物來源的DRG神經元研究較少，在某些方面，非嚙齒類動物DRG神經元與人DRG神經元更相似，如犬DRG神經元中神經節苷脂的新陳代謝與人DRG神經元中的更相似［17］。有研究表明，對于一些神經系統疾病比如萊姆病（Lyme disease），伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）在恒河猴中的感染與人類萊姆病的早期傳播相似，因此恒河猴DRG神經元是研究萊姆病發生機制及防治的經典模型［18-19］。此外，犬DRG神經元對辣椒素和異硫氰酸烯丙酯（allyl-isothiocy?anate）比嚙齒類動物DRG神經元更敏感，表明嚙齒類與非嚙齒類動物DRG神經元之間存在差異［20］。相較于嚙齒類動物，非嚙齒類動物因壽命更長、環境暴露和自發的疾病情況與人類更接近等因素，在藥物神經毒性等研究中轉化為臨床研究更具有優勢［20］。

2.1.3 人類

實驗室很難獲得人外周神經組織，不僅是因為DRG中含有許多感覺神經元，在傳遞疼痛信息方面發揮重要作用，很難甚至不可能從活體獲得DRG神經元，且還涉及倫理問題［13］。Davidson等［21］研究發現，中小型DRG神經元動作電位持續時間長，可能是由鈣和鈉通道內流引起，且人DRG神經元中的大多數神經元可對異硫氰酸烯丙酯、組胺和氯喹等致敏原產生反應。電壓門控鈉離子通道在DRG神經元動作電位的產生中具有關鍵作用。Chang等［22］發現，在人DRG神經元中，Nav1.7通道表達約占電壓門控鈉離子通道表達的50%，而Nav1.8通道表達較低，約占12%。目前應用人DRG神經元的研究數量有限，其替代模型的研究至關重要［23］。

2.2 間接來源的背根神經節神經元

2.2.1 多能干細胞

hPSC是能分化為人體所有細胞類型的干細胞，包括人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESC）和人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）2大類。Alshawaf等［24］對hESC分化的DRG神經元形態和功能研究發現，hESC分化的DRG神經元能夠表達感覺神經元標志物大腦-特定同源框/POU結構域蛋白3A（brain-specific homeobox/POU domain protein 3A）和ISL LIM同源框蛋白1（ISL LIM homeo?box 1），分化后約12 d開始出現自發放電，隨后放電率（spike rate，SR）繼續增加，分化約6周時SR達最大，為（258.2±102.5）-1。然而，由于hESC可能引起倫理爭議，近些年一些研究者轉向hiPSC的研究并成功分化得到外周神經元［25-26］。Chambers等［27］采用小分子抑制劑組合（SU5402，HIR99021和DAPT等）將hiPSC誘導分化為外周神經元，此后這種方法被許多研究者優化改進，如改變小分子抑制劑的濃度或增加神經營養因子3以提高分化效率，用以開展疼痛體外表型篩選及藥物神經毒性評價等研究［28］。當前也有公司推出商業化的hiPSC分化的外周神經元產品，如Ncardia公司的Peri.4U。盡管hPSC分化的神經元可大量獲取，但hPSC在分化過程中很可能出現異源細胞，從而影響實驗結果，這一點需要引起研究者的重視［29］。

2.2.2 成纖維細胞

除干細胞分化可得到DRG神經元外，成纖維細胞也可直接重編程為DRG神經元。2015年，Blanchard等［30］采用與DRG神經元相關的轉錄因子將人和小鼠的成纖維細胞直接重編程為DRG神經元，這些神經元具有感覺神經元的形態和電生理活性，并與內源性感覺神經元的特征基因和受體表達一致，如重編程獲得的神經元選擇性表達Trk。在成纖維細胞重編程過程中，轉錄因子的選擇至關重要。Wainger等［31］從12種候選轉錄因子中選出5種轉錄因子 ASCL1，MYT1L，KLF7，NGN1和ISL2用于成纖維細胞的重編程，同時也發現重編程得到的DRG神經元能表達Nav1.8、TRPV1和瞬時受體電位錨蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）等通道。在成纖維細胞重編程的過程中很少出現異源細胞，避免了干細胞分化過程中可能出現的致瘤性問題［3，32］。

2.3 背根神經節神經元體外模型的優勢和局限性

早期大部分研究采用的DRG神經元均來源于動物模型，近年來研究更為廣泛的為hPSC分化和人成纖維細胞重編程獲得的DRG神經元［33］。相較于動物模型，體外間接來源的DRG神經元與人DRG神經元更接近，可著減少實驗動物的使用，滿足動物福利的要求，有望更好地代替人DRG神經元用于藥物高通量篩選、神經毒性評價和疾病模型建立等［28，34-35］。與此同時，間接獲得DRG神經元的過程也有一些亟待解決的問題，如分化或重編程方案、外周神經元亞型的軸突髓鞘化以及DRG神經元的分化效率等［25，36］。另一個需要考慮的問題是需要比較體外外周神經元與人DRG神經元的一致性，未來需要繼續優化分化或重編程方案以減少兩者間的差異［3］。

3 背根神經節在藥物神經毒性研究中的應用

由于缺乏有效的屏障保護，以及周圍分布的豐富毛細血管，DRG神經元易受到藥物誘導的神經毒性損害［37］。目前臨床許多藥物在發揮治療作用同時也會引起神經毒性不良反應，其中以抗腫瘤藥、鎮痛藥和麻醉藥最多。不同化合物的神經毒性機制不同，在新藥研發早期，及時發現候選化合物引起神經毒性的潛在風險至關重要。

3.1 抗腫瘤藥

DRG神經元體外模型在抗腫瘤藥誘導的神經毒性研究中應用廣泛，目前已用于藥物高通量篩選、神經毒性評價和毒性機制研究［38-40］。近年來，體外間接獲得的DRG神經元備受關注，有研究者采用hPSC分化的神經元評價化療藥物誘導的外周神經毒性（chemotherapy-induced peripheral neuro?toxicity，CIPN），并且篩選出具有CIPN風險的抗腫瘤藥，降低了臨床神經系統不良反應的發生率［41-42］。然而，間接來源的DRG神經元，尤其是重編程獲得的DRG神經元，在CIPN機制研究中的應用還比較少，未來還具有很大的研究空間。

Hoelting等［43］應用hPSC分化的DRG神經元模型成功建立了識別外周神經毒性化合物的高通量篩選系統，其中DRG神經元模型的來源以及高通量篩選方法的選擇對CIPN高通量篩選具有重要影響。Wing等［44］通過細胞活力、高內涵成像和微電極陣列（microelectrode array，MEA）技術比較hiPSC分化的皮質神經元和DRG神經元對順鉑和硼替佐米等抗腫瘤藥的敏感性，結果表明，hiPSC分化的DRG神經元模型用于CIPN評價的敏感性和準確性更高，同時進一步證實了DRG神經元為抗腫瘤藥誘發外周神經毒性的靶點。此外，有研究表明，DRG神經元細胞膜上離子通道改變能引起神經元興奮性增高，而神經元興奮性增高是CIPN發生的重要機制［45］。Li等［46］發現，紫杉醇可引起大鼠和人DRG神經元中Nav1.7通道表達上調，引起DRG神經元興奮性增高，從而產生外周神經毒性。此外，CIPN在線粒體功能障礙、氧化應激、神經炎癥和膠質細胞等方面也有很多相關機制研究［47-49］。

3.2 鎮痛藥

有文獻報道，DRG神經元是鎮痛藥發揮作用的關鍵靶點，對新型鎮痛藥的研發具有重要作用［50］。DRG神經元表達的Nav1.7通道與疼痛的發生機制密切相關，選擇性阻斷Nav1.7通道能增加DRG神經元的放電閾值，并引起CGRP遞質釋放減少［51］。此外，TRPV1和TRPA1通道在DRG神經元中表達較多，炎癥和神經損傷會改變DRG神經元內TRPV1和TRPA1的表達和功能，從而產生慢性疼痛［52-53］。目前一些TRP通道拮抗劑已作為鎮痛藥進行研發，如一些強效的小分子TRPA1通道拮抗劑已進入治療神經性疼痛的臨床試驗，TRPM8通道拮抗劑也用于治療冷觸痛［54-55］。除DRG神經元的鈉離子通道、TRP通道和炎癥反應參與疼痛機制研究外，膠質細胞和交感神經機制也在一定程度上參與了疼痛。目前以DRG神經元為靶點的基因治療和干細胞療法在鎮痛藥研發上已取得一定進展，但仍存在許多挑戰，如干細胞的再生、修復和鎮痛作用仍不確定［56］。

3.3 麻醉藥

全身麻醉藥的應用可能會導致患者出現嚴重不可逆的神經毒性，也會對患者的神經行為造成嚴重影響。局部麻醉藥如利多卡因、羅哌卡因和布比卡因在臨床上也可能引起外周神經毒性，已有研究者應用嚙齒類動物DRG神經元對局麻藥引起的神經毒性進行機制研究［57］。敲除鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱβ亞型基因可保護DRG神經元免受羅哌卡因誘導的神經毒性的影響，提高細胞存活率，減少細胞凋亡，并使T型電壓門控鈣離子通道的表達下調［58］。另外，Zhang等［59］采用小鼠 DRG 神經元模型探討腫瘤壞死因子信號通路在布比卡因誘導的神經毒性中的作用，研究發現，腫瘤壞死因子-α對防治麻醉藥引起的DRG神經元凋亡損傷具有關鍵作用。當前已有多種手段可減輕麻醉藥誘導的神經毒性，如下調微RNA或應用蟲草素等［60］。未來更多不同來源的DRG神經元模型還可用于研究麻醉藥誘導的神經毒性，為臨床安全用藥提供參考。

3.4 其他

上述3類藥物在臨床上均有明顯的外周神經毒性癥狀，且已有基于DRG神經元模型的毒性評價和機制研究的相關報道，然而有關其他藥物的報道很少，可能是因為DRG神經元僅針對于藥物誘導的外周神經毒性，對藥物誘導的中樞神經毒性不適用。目前僅發現吡哆醇可引起DRG神經元壞死和周圍感覺纖維退化，其引起的神經病變的癥狀與CIPN相似［61］。另外，DRG神經元也已用于一些化合物誘導的神經毒性研究，如研究發現甲基汞對大鼠DRG神經元的外周神經毒性與小膠質細胞/巨噬細胞的增加與施萬細胞的增殖有關［62］。

4 結語

DRG神經元是研究藥物神經毒性尤其是外周神經毒性重要的體外模型，在藥物篩選、毒性評價和機制研究等多方面發揮關鍵作用。近年干細胞分化和成纖維細胞重編程領域的快速發展，使研究者可獲得大量的hPSC和成纖維細胞來源的DRG神經元，為藥物神經毒性的研究提供了充足且可靠的體外DRG神經元模型［3］。然而，在體外DRG神經元能完全模擬人DRG神經元之前，仍然存在許多困難，干細胞的誘導分化方案、成纖維細胞的重編程方法以及DRG神經元的純度仍需不斷優化，DRG神經元的應用領域可進一步擴展，藥物外周神經毒性機制研究還有待加強。未來還需要增強新型體外神經毒性研究模型的驗證，使神經毒性相關指標的研究更加標準和全面，從而更加準確、靈敏地預測候選化合物神經毒性，為后續實驗研究和臨床試驗研究提供參考。